Summary

Gebruik van in vivo single-Fiber opname en intact dorsale wortel ganglion met bijgevoegde Sciatische zenuw om het mechanisme van geleidings falen te onderzoeken

Published: August 27, 2019
doi:

Summary

Single-Fiber opname is een effectieve elektrofysiologische techniek die toepasbaar is op de centrale en perifere zenuwstelsels. Samen met de voorbereiding van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw, het mechanisme van geleiding falen wordt onderzocht. Beide protocollen verbeteren het begrip van de relatie van het perifere zenuwstelsel met pijn.

Abstract

Single-Fiber opname is de laatste decennia een klassieke en effectieve elektrofysiologische techniek geweest vanwege de specifieke toepassing voor zenuwvezels in de centrale en perifere zenuwstelsels. Deze methode is met name van toepassing op dorsale wortel ganglia (DRG), die primaire sensorische neuronen zijn die een pseudo-unipolaire structuur van zenuw processen vertonen. De patronen en kenmerken van de actie potentialen doorgegeven langs axonen zijn beschrijfbare in deze neuronen. De huidige studie gebruikt in vivo single-Fiber opnames om de geleiding falen van de sciatische zenuwen in volledige Freund van adjuvans (CFA) behandelde ratten te observeren. Omdat het onderliggende mechanisme niet kan worden bestudeerd met behulp van in vivo single-Fiber opnames, worden Patch-clamp-opnames van DRG neuronen uitgevoerd op preparaten van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw. Deze opnames onthullen een positieve correlatie tussen geleidings falen en de stijgende helling van de nahyperpolarisatie potentiaal (AHP) van DRG-neuronen bij met CFA behandelde dieren. Het protocol voor in vivo enkelvoudige glasvezel opnames maakt de classificatie van zenuwvezels mogelijk via de meting van de geleidings snelheid en het monitoren van abnormale omstandigheden in zenuwvezels bij bepaalde ziekten. Intact DRG met bijgevoegde perifere zenuw maakt observatie van de activiteit van DRG neuronen in de meeste fysiologische omstandigheden. Overtuigend, single-Fiber opname gecombineerd met elektrofysiologische opname van intacte Drg’s is een effectieve methode om de rol van geleidings falen tijdens het analgetische proces te onderzoeken.

Introduction

De normale overdracht van informatie langs zenuwvezels garandeert de normale werking van het zenuwstelsel. Abnormale werking van het zenuwstelsel wordt ook weerspiegeld in de elektrische signaaloverdracht van zenuwvezels. Zo kan de mate van demyelinisatie bij centrale demyelineaflaesies worden geclassificeerd via vergelijking van veranderingen in zenuw geleidings snelheid voor en na interventie toepassing1. Het is moeilijk om intracellulair record zenuwvezels, behalve in speciale preparaten zoals de inktvis reus axon2. Daarom is elektrofysiologische activiteit alleen beschrijfbare via de extracellulaire opname van enkelvoudige vezels. Als een van de klassieke elektrofysiologische methoden, heeft single-Fiber opname een langere geschiedenis dan andere technieken. Echter, minder elektrofysiologen grijpen deze methode ondanks de uitgebreide toepassing. Daarom is een gedetailleerde introductie van het standaardprotocol voor de opname van één vezel nodig voor de juiste toepassing.

Hoewel verschillende Patch-clamp technieken moderne elektrofysiologische studie hebben gedomineerd, speelt single-Fiber opname nog steeds een onvervangbaar rol bij het opnemen van de activiteiten van zenuwvezels, vooral vezels die perifeer gevoel overbrengen met hun sensorische cel lichaam gelegen in dorsale wortel ganglion (DRG). Het voordeel van het gebruik van single-Fiber opname hier is dat in vivo Fiber Recording een lange observatietijd biedt met de capaciteit om reacties op natuurlijke stimuli op te nemen in preklinische modellen zonder verstoring van de intracellulaire omgeving3 , 4.

Een toenemend aantal studies in de afgelopen twee decennia heeft onderzocht complexe functies langs zenuwvezels5, en geleiding falen, die wordt gedefinieerd als een staat van mislukte zenuw impuls transmissie langs de axon, was aanwezig in veel verschillende perifere zenuwen6,7. De aanwezigheid van geleidings falen in ons onderzoek diende als een intrinsiek Zelfremmend mechanisme voor de modulatie van aanhoudende Nociceptieve input langs C-vezels8. Dit geleidings falen was significant verzwakt onder de voorwaarden van hyperalgesia4,9. Daarom, gericht op de factoren die betrokken zijn bij conductie falen kan een nieuwe behandeling voor neuropathische pijn vertegenwoordigen. Om het geleidings falen te observeren, moet het afvuren patroon worden geregistreerd en geanalyseerd op basis van opeenvolgend geloosde spikes op basis van single-Fiber opname.

Om het mechanisme van geleidings falen grondig te begrijpen, is het noodzakelijk om de transmissie eigenschappen van de axon te identificeren, of preciezer, de membraan eigenschappen van DRG-neuronen, gebaseerd op hun pseudo-unipolaire anatomische eigenschappen. Veel eerdere studies op dit gebied zijn uitgevoerd op gezien DRG neuronen10,11, die mogelijk niet haalbaar voor het onderzoek van de geleiding falen als gevolg van twee obstakels. Eerste, verschillende mechanische en chemische methoden worden gebruikt in het dissociatie proces te vrije DRG neuronen, die kan resulteren in ongezonde cellen of verander het fenotype/eigenschappen van de neuronen en Verwar de bevindingen. Ten tweede, de bijgevoegde perifere zenuwen zijn in principe verwijderd, en geleiding falen verschijnselen zijn niet waarneembaar in deze preparaten. Daarom is een preparaat van intact DRG neuronen met een bijgevoegde zenuw verbeterd om te voorkomen dat de bovengenoemde obstakels.

Protocol

Het huidige protocol volgde de leidraad voor het beleid van de Amerikaanse volksgezondheid over de humane verzorging en het gebruik van proefdieren, en het Comité voor de ethiek van dierproeven van de vierde militaire medische universiteit keurde het protocol goed. 1. dieren Verdeel 24 Sprague-Dawley ratten (4-8 weken oud) in twee groepen. Produceer volledig Freund’s adjuvans (CFA) model door intraplantar injectie van 100 μL CFA in één groep van 14 ratten en een andere groep van …

Representative Results

De uitkomst van het single-Fiber opname protocol is afhankelijk van de kwaliteit van de vezel dissectie. Het dier voor in vivo experimenten moet in een goede situatie verkeren om de zenuw stam gezond te houden voor gemakkelijk dissectie (zie advies in de sectie discussie). Een drug toepassing bad is nodig in veel gevallen voor de levering van geneesmiddelen op vezels. Figuur 1 illustreert hoe de in vivo single-Fiber opname werd bediend (Figuur 1a) en presenteert een klassiek…

Discussion

Hoewel recente studies calcium beeldvorming van DRG-neuronen in vivo16hebben bereikt, blijft het uitvoeren van in vivo Patch-clamp-opnames van individuele DRG-nociceptoren uiterst uitdagend. Daarom is een in vivo single-Fiber aanpak voor het pijn veld van blijvende betekenis. Single-Fiber opname in dit protocol laat objectieve observatie van geleidings falen verschijnselen toe, en de combinatie van deze techniek met het ex vivo preparaat dat in de huidige studie is ontwikkeld, maakt het onderzoek …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de financiering van de National Natural Science Foundation of China (31671089 en 81470060) en het Shaanxi Provincial Social Development Science and Technology Research project (2016SF-250).

Materials

Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier Nihon kohden MEZ-8201 Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor ShangHai JiaLong Teaching instrument factory SZF-1 Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system CED Spike-2 Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator Narishige SM-21 Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers A.Dumont 5# Separate the single fiber
Isolator Nihon kohden SS-220J
Memory oscilloscope Nihon kohden VC-9 Display recorded discharge during
experiment
Stereomicroscope ZEISS SV-11 Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator Nihon kohden SEZ-7203 Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair Stoelting accompany Delivery of the mechanical stimuli
Water bath Scientz biotechnology Co., Ltd. SC-15 Heating paroline to maintain at 37oC
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier Axon Instruments Multiclamp 700B Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table Optical Technology Co., Ltd. Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera Olympus TH4-200 See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex Axon Clampex 9.2 Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit Axon Clampfit 10.0 Software for data analysis
Electrode puller Sutter P-97 Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette Sutter BF 150-75-10
Micromanipulator Sutter MP225 Give a precise control of the microelectrode
Microscope Olympus BX51WI Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin Origin lab Origin 8 Software for drawing picture
Perfusion Pump BaoDing LanGe Co., Ltd. BT100-1J Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance Sartorius BS 124S Weighing reagent
pH Modulator Denver Instrument UB7 Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Extracellular solution
Chloralose Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. M07752 Mixed solution for Anesthesia
Collagenase Sigma-Aldrich SLBQ1885V Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose Sigma-Aldrich G7528 Extracellular solution
Liquid Paraffin TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911 Extracellular solution
Protease Sigma-Aldrich 62H0351 Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5671 Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751 Extracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Extracellular solution
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Mixed solution for Anesthesia

References

  1. Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
  2. Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
  3. Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
  4. Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, 359-375 (2012).
  5. Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
  6. De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
  7. Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
  8. Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
  9. Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
  10. Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
  11. Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
  12. Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
  13. Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
  14. Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).
  15. Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
  16. Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  17. Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
  18. Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
  19. Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
  20. Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
  21. Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  22. Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
  23. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
  24. Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).

Play Video

Cite This Article
Mao, H., Wang, X., Chen, W., Liu, F., Wan, Y., Hu, S., Xing, J. Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure. J. Vis. Exp. (150), e59234, doi:10.3791/59234 (2019).

View Video