전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용
Summary
단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계에 적용할 수 있는 효과적인 전기 생리학적 기술입니다. 부착 된 동골 신경과 함께 손상되지 않은 DRG의 준비와 함께 전도 실패의 메커니즘을 검사합니다. 두 프로토콜 모두 말초 신경계의 통증과의 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.
Abstract
단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계의 신경 섬유에 대한 특정 응용 프로그램 때문에 지난 수십 년 동안 고전적이고 효과적인 전기 생리학적 기술이었습니다. 이 방법은 신경 과정의 의사 단극 구조를 나타내는 기본 감각 뉴런인 등쪽 뿌리 신경절(DRG)에 특히 적용됩니다. 축색을 따라 전달 된 행동 전거의 패턴과 특징은 이러한 뉴런에서 기록 할 수 있습니다. 본 연구는 완전한 Freund의 보조제 (CFA) 처리 된 쥐에서 심막 신경의 전도 실패를 관찰하기 위해 생체 내 단일 섬유 기록을 사용합니다. 기본 메커니즘은 생체 내 단일 섬유 기록을 사용하여 연구 할 수 없기 때문에, DRG 뉴런의 패치 클램프 기록은 부착 된 sciatic 신경과 그대로 DRG의 준비에 수행됩니다. 이 기록은 CFA 처리한 동물에 있는 DRG 뉴런의 전도 실패그리고 후 과분극 전위 전위 (AHP)의 상승 경사 사이 긍정적인 상관관계를 밝힙니다. 생체 내 단일 섬유 기록을 위한 프로토콜은 특정 질병에 있는 신경 섬유에 있는 전도 속도의 측정 및 감시를 통해 신경 섬유의 분류를 허용합니다. 부착 된 말초 신경과 그대로 DRG는 대부분의 생리 적 조건에서 DRG 뉴런의 활성을 관찰 할 수 있습니다. 결정적으로, 손상되지 않은 DRGs의 전기 생리학적 기록과 결합된 단일 섬유 기록은 진통 과정 동안 전도 실패의 역할을 검사하는 효과적인 방법입니다.
Introduction
신경 섬유를 따라 정보의 정상적인 전송은 신경계의 정상적인 기능을 보장합니다. 신경계의 비정상적인 기능은 또한 신경 섬유의 전기 신호 전송에 반영됩니다. 예를 들어, 중앙 탈수질 병변에서의 탈수초화 정도는 개입 적용 전후의 신경 전도 속도의변화의 비교를 통해 분류될 수 있다 1. 오징어 거대 축2와 같은 특별한 준비를 제외하고는 세포내 신경 섬유를 기록하기가어렵습니다. 따라서, 전기 생리활성은 단일 섬유의 세포외 기록을 통해서만 기록할 수 있다. 고전 전기 생리학적 방법 중 하나로서, 단일 섬유 기록은 다른 기술보다 더 긴 역사를 가지고 있다. 그러나 광범위한 적용에도 불구하고이 방법을 파악하는 전기 생리학자는 적습니다. 따라서, 단일 섬유 기록을 위한 표준 프로토콜의 상세한 도입은 그것의 적당한 신청을 위해 필요합니다.
다양한 패치 클램프 기술이 현대 전기 생리학 연구를 지배했지만, 단일 섬유 기록은 여전히 신경 섬유의 활동, 특히 주변 감각을 전달하는 섬유의 활동을 기록하는 데 대체 할 수없는 역할을합니다. 등지 뿌리 신경절 (DRG)에 위치한 감각 세포 체. 여기서 단일 섬유 기록을 사용하는 장점은 생체 내 섬유 기록이 세포 내 환경의 장애 없이 전임상 모델에서 자연 자극에 대한 반응을 기록할 수 있는 용량으로 긴 관찰 시간을 제공한다는 것입니다3 , 4.
지난 2 년간 연구의 증가 수는 신경 섬유를 따라복잡한 기능을 검사했다 5, 그리고 전도 실패, 이는 축을 따라 실패 신경 충동 전송의 상태로 정의, 많은 다른존재했다 말초 신경6,7. 우리의 조사에서 전도 실패의 존재는 C 섬유8을따라 지속적인 nociceptive 입력의 변조를 위한 본질적인 자기 억제 기계장치로 봉사했습니다. 이러한 전도 장애는 과민증4,9의조건하에서 현저히 감쇠되었다. 따라서, 전도 실패에 관여하는 인자를 표적으로 하는 것은 신경병성 통증에 대한 새로운 치료를 나타낼 수 있다. 전도 실패를 관찰하기 위해 단일 섬유 기록에 기초하여 순차적으로 배출된 스파이크를 기준으로 소성 패턴을 기록하고 분석해야 합니다.
전도 실패의 메커니즘을 철저히 이해하려면 의사 단극 성 해부학 적 특성에 따라 축축한 축색의 전송 특성, 또는 보다 정확하게 DRG 뉴런의 막 특성을 식별해야합니다. 이 필드에 있는 많은 이전 연구 결과는 2개의 장애물때문에 전도 실패의 조사를 위해 가능하지 않을 지도 모르다 해리된 DRG 신경 10,11에실행되었습니다. 첫째, 다양한 기계적 및 화학적 방법은 DRG 뉴런을 무료로 해리 과정에서 사용되며, 이는 건강에 해로운 세포를 초래하거나 뉴런의 표현형 / 특성을 변경하고 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 둘째, 부착 된 말초 신경은 기본적으로 제거되고 전도 실패 현상은 이러한 준비에서 관찰 할 수 없습니다. 따라서, 부착된 신경을 가진 손상되지 않은 DRG 뉴런의 제제는 상기 장애물을 피하기 위해 개선되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최근 연구는 생체 내에서 DRG 뉴런의 칼슘 이미징을 달성했지만16,개별 DRG nociceptors에서 생체 패치 클램프 기록을 수행하는 것은 매우 어려운 남아있다. 따라서, 통증 분야에 대한 생체 내 단일 섬유 접근법은 지속적으로 중요하다. 본 프로토콜에서 단일 섬유 기록은 전도 실패 현상의 객관적인 관찰을 허용하고, 현재 연구에서 개발 된 생체 전 제제와이 기술의 조합은 기본 메커니…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 중국 국립자연과학재단(31671089 및 81470060)과 산시성 사회개발과학기술연구사업(2016SF-250)의 지원으로 지원되었다.
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
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