Användning av in vivo Single-fiber inspelning och intakt dorsala root ganglion med bifogade ischiasnerven att undersöka mekanismen för överledning misslyckande
Summary
Single-fiber inspelning är en effektiv Elektrofysiologisk teknik som är tillämplig på den centrala och perifera nervsystemet. Tillsammans med beredningen av intakt DRG med den bifogade ischiasnerven, mekanismen för överledning misslyckande undersöks. Båda protokollen förbättrar förståelsen av det perifera nervsystemets relation till smärta.
Abstract
Single-fiber inspelning har varit en klassisk och effektiv Elektrofysiologisk teknik under de senaste decennierna på grund av dess specifika tillämpning för nervfibrer i den centrala och perifera nervsystemet. Denna metod är särskilt tillämplig på dorsala root ganglier (DRG), som är primära sensoriska nervceller som uppvisar en pseudo-unipolär struktur av nerv processer. De mönster och funktioner i åtgärden potentialer passerade längs axoner är inspelningsbara i dessa nervceller. Den nuvarande studien använder in vivo Single-fiber inspelningar för att observera lednings svikt av ischiasnerven i komplett Freunds adjuvans (CFA)-behandlade råttor. Eftersom den bakomliggande mekanismen inte kan studeras med in vivo Single-fiber inspelningar, patch-Clamp-inspelningar av DRG neuroner utförs på preparat av intakt DRG med den bifogade ischiasnerven. Dessa inspelningar avslöjar en positiv korrelation mellan överledning misslyckande och den stigande lutningen av efter-hyperpolarisering potential (AHP) av DRG neuroner i CFA-behandlade djur. Protokollet för in vivo Single fiber-inspelningar tillåter klassificering av nervfibrer via mätning av överledning hastighet och övervakning av onormala förhållanden i nervtrådar i vissa sjukdomar. Intakt DRG med bifogade perifera nerv tillåter observation av aktiviteten av DRG nervceller i de flesta fysiologiska förhållanden. Slutgiltigt, Single-fiber inspelning kombinerat med elektrofysiologiska inspelningen av intakt DRGs är en effektiv metod för att undersöka rollen av överledning misslyckande under den analgetiska processen.
Introduction
Den normala överföringen av information längs nervfibrer garanterar den normala funktionen av nervsystemet. Onormal funktion av nervsystemet återspeglas också i den elektriska signalen överföring av nervfibrer. Till exempel, graden av demyelinisering i centrala demyelinisering lesioner kan klassificeras genom jämförelse av förändringar i nerv överledning hastighet före och efter intervention ansökan1. Det är svårt att intracellulärt spela in nervfibrer, utom i speciella preparat som bläckfisk jätten Axon2. Därför är Elektrofysiologisk aktivitet endast inspelningsbar via den extracellulära inspelningen av enstaka fibrer. Som en av de klassiska elektrofysiologiska metoder, Single-fiber inspelning har en längre historia än andra tekniker. Emellertid, färre Elektrofysiologer gripa denna metod trots dess omfattande tillämpning. Därför behövs en detaljerad introduktion av standardprotokollet för enkel fiber inspelning för dess lämpliga tillämpning.
Även om olika patch-Clamp tekniker har dominerat modern Elektrofysiologisk studie, Single-fiber inspelning spelar fortfarande en oersättlig roll i inspelningen av verksamheten i nervfibrer, särskilt fibrer som sänder perifer känsla med sina sensorisk cellkroppen ligger i dorsala root ganglion (DRG). Fördelen med att använda Single-fiber inspelning här är att in vivo fiber Recording ger en lång observationstid med kapacitet att spela in svar på naturliga stimuli i prekliniska modeller utan störning i den intracellulära miljön3 , 4.
Ett ökande antal studier under de senaste två decennierna har undersökt komplexa funktioner längs nervfibrer5, och överledning misslyckande, som definieras som ett tillstånd av misslyckade nervimpuls överföring längs Axon, var närvarande i många olika perifera nerver6,7. Närvaron av lednings svikt i vår undersökning fungerade som en inneboende självhämmande mekanism för modulering av ihållande nociceptiva input längs C-fibrer8. Detta retledningmisslyckande var signifikant försvagat under förhållanden av hyperalgesi4,9. Därför, inriktning de faktorer som deltar i överledning misslyckande kan representera en ny behandling för neuropatisk smärta. För att observera lednings svikt, bör skott mönstret registreras och analyseras på grundval av sekventiellt urladdade spikar baserade på Single-fiber inspelning.
För att grundligt förstå mekanismen för överledning misslyckande, är det nödvändigt att identifiera överförings egenskaperna hos Axon, eller mer exakt, membran egenskaper DRG neuroner, baserat på deras pseudo-Unipolar anatomiska egenskaper. Många tidigare studier på detta område har utförts på separerade DRG neuroner10,11, som kanske inte är möjligt för utredning av lednings svikt på grund av två hinder. Först, olika mekaniska och kemiska metoder används i dissociation processen för att frigöra DRG nervceller, vilket kan resultera i ohälsosamma celler eller ändra fenotyp/egenskaper av nervceller och blanda ihop resultaten. För det andra är den bifogade perifera nerver i princip bort, och överledning misslyckande fenomen är inte observerbara i dessa preparat. Därför, en beredning av intakt DRG nervceller med en bifogad nerv har förbättrats för att undvika de ovan nämnda hindren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om nyligen genomförda studier har uppnått kalcium avbildning av DRG neuroner in vivo16, utför in vivo patch-klämma inspelning från enskilda DRG Nociceptorerna fortfarande extremt utmanande. Därför är en in vivo Single-fiber metod för smärt området är av fortsatt betydelse. Single-fiber inspelning i detta protokoll tillåter objektiv observation av överlednings fel fenomen, och kombinationen av denna teknik med ex vivo preparatet som utvecklats i den aktuella studien möjliggör …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av finansiering från National Natural Science Foundation i Kina (31671089 och 81470060) och Shaanxi Provincial social Development vetenskap och teknikforskningsprojekt (2016SF-250).
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
