Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Summary

La grabación de una sola fibra es una técnica electrofisiológica eficaz que es aplicable a los sistemas nerviosos central y periférico. Junto con la preparación de DRG intacto con el nervio ciático adjunto, se examina el mecanismo de falla de conducción. Ambos protocolos mejoran la comprensión de la relación del sistema nervioso periférico con el dolor.

Abstract

La grabación de una sola fibra ha sido una técnica electrofisiológica clásica y eficaz en las últimas décadas debido a su aplicación específica para las fibras nerviosas en los sistemas nerviosos central y periférico. Este método es particularmente aplicable a los ganglios de raíz dorsal (DRG), que son neuronas sensoriales primarias que exhiben una estructura pseudo-unipolar de los procesos nerviosos. Los patrones y características de los potenciales de acción pasados a lo largo de los axons son grabables en estas neuronas. El presente estudio utiliza grabaciones in vivo de una sola fibra para observar el fallo de conducción de los nervios ciáticos en ratas tratadas con adyuvantes (CFA) completas de Freund. Como el mecanismo subyacente no se puede estudiar utilizando grabaciones in vivo de una sola fibra, las grabaciones de abrazaderas de parche de las neuronas DRG se realizan en preparaciones de DRG intacto con el nervio ciático adjunto. Estas grabaciones revelan una correlación positiva entre la falla de conducción y la pendiente creciente del potencial de hiperpolarización posterior (AHP) de las neuronas DRG en animales tratados con CFA. El protocolo para las grabaciones de fibra individualin vivo permite la clasificación de las fibras nerviosas a través de la medición de la velocidad de conducción y el seguimiento de condiciones anormales en las fibras nerviosas en ciertas enfermedades. El DRG intacto con el nervio periférico conectado permite la observación de la actividad de las neuronas DRG en la mayoría de las condiciones fisiológicas. De manera concluyente, la grabación de una sola fibra combinada con el registro electrofisiológico de DRG intactos es un método eficaz para examinar el papel de la falla de conducción durante el proceso analgésico.

Introduction

La transmisión normal de información a lo largo de las fibras nerviosas garantiza el funcionamiento normal del sistema nervioso. El funcionamiento anormal del sistema nervioso también se refleja en la transmisión de la señal eléctrica de las fibras nerviosas. Por ejemplo, el grado de desmielinización en lesiones de desmielinización central se puede clasificar mediante la comparación de los cambios en la velocidad de conducción nerviosa antes y después de la aplicación de intervención¹. Es difícil registrar intracelularmente las fibras nerviosas, excepto en preparaciones especialescomo el axón gigante calamar 2. Por lo tanto, la actividad electrofisiológica sólo se puede grabar a través de la grabación extracelular de fibras individuales. Como uno de los métodos electrofisiológicos clásicos, la grabación de una sola fibra tiene una historia más larga que otras técnicas. Sin embargo, menos electrofisiólogos que entienden este método a pesar de su amplia aplicación. Por lo tanto, se necesita una introducción detallada del protocolo estándar para la grabación de una sola fibra para su aplicación adecuada.

Aunque varias técnicas de abrazaderade parche han dominado el estudio electrofisiológico moderno, la grabación de una sola fibra sigue desempeñando un papel insustituible en el registro de las actividades de las fibras nerviosas, especialmente las fibras que transmiten la sensación periférica con sus cuerpo de células sensoriales ubicado en ganglio de la raíz dorsal (DRG). La ventaja de utilizar la grabación de una sola fibra aquí es que la grabación de fibra in vivo proporciona un largo tiempo de observación con la capacidad de registrar respuestas a estímulos naturales en modelos preclínicos sin perturbación del entorno intracelular^{3 , 4}.

Un número creciente de estudios en las últimas dosdécadas ha examinado funciones complejas a lo largo de las fibras nerviosas 5, y la falla de conducción, que se define como un estado de transmisión de impulso nervioso sin éxito a lo largo del axón, estuvo presente en muchos nervios periféricos^6,7. La presencia de fallo de conducción en nuestra investigación sirvió como un mecanismo autoinhibitorio intrínseco para la modulación de la entrada nociceptiva persistente a lo largo de las fibras C⁸. Esta falla de conducción se atenuó significativamente encondiciones de hiperalgesia 4,⁹. Por lo tanto, apuntar a los factores involucrados en la insuficiencia de conducción puede representar un nuevo tratamiento para el dolor neuropático. Para observar el fallo de conducción, el patrón de disparo debe registrarse y analizarse sobre la base de picos descargados secuencialmente basados en la grabación de una sola fibra.

Para entender a fondo el mecanismo de fallo de conducción, es necesario identificar las propiedades de transmisión del axón, o más precisamente, las propiedades de la membrana de las neuronas DRG, en función de sus propiedades anatómicas pseudo-unipolares. Muchos estudios previos en este campo se han realizado en neuronas DRG disociadas^10,11, que pueden no ser factibles para la investigación de falla de conducción debido a dos obstáculos. En primer lugar, varios métodos mecánicos y químicos se utilizan en el proceso de disociación a las neuronas DRG libres, que puede resultar en células insalubres o alterar el fenotipo / propiedades de las neuronas y confundir los hallazgos. En segundo lugar, los nervios periféricos conectados se eliminan básicamente, y los fenómenos de falla de conducción no son observables en estas preparaciones. Por lo tanto, se ha mejorado una preparación de las neuronas DRG intactas con un nervio unido para evitar los obstáculos antes mencionados.

Protocol

El protocolo actual siguió la Guía para la Política del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio, y el Comité de la ética de los experimentos con animales de la Cuarta Universidad Médica Militar aprobó el protocolo. 1. Animales Divida 24 ratas Sprague-Dawley (4-8 semanas de edad) en dos grupos. Producir el modelo completo de adyuvante de Freund (CFA) mediante inyección intraplantar de 100 ml de CFA en un grupo de 14 ra…

Representative Results

El resultado del protocolo de grabación de una sola fibra depende de la calidad de la disección de fibra. El animal para experimentos in vivo debe estar en una buena situación para mantener el tronco nervioso sano para facilitar la disección (ver consejos en la sección de discusión). Un baño de aplicación de drogas es necesario en muchos casos para el suministro de drogas en fibras. La Figura 1 ilustra cómo se accionó la grabación in vivo de una sola fibra (Figura1A)</stro…

Discussion

Aunque estudios recientes han logrado imágenes de calcio de las neuronas DRG in vivo¹⁶, realizar la grabación in vivo parche-clamp de nociceptores DRG individuales sigue siendo extremadamente difícil. Por lo tanto, un enfoque in vivo de una sola fibra para el campo del dolor es de importancia continua. El registro de una sola fibra en el presente protocolo permite la observación objetiva de los fenómenos de fallo de conducción, y la combinación de esta técnica con la preparación ex vivo d…

Materials

Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier	Nihon kohden	MEZ-8201	Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor	ShangHai JiaLong Teaching instrument factory	SZF-1	Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system	CED	Spike-2	Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator	Narishige	SM-21	Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers	A.Dumont	5#	Separate the single fiber
Isolator	Nihon kohden	SS-220J
Memory oscilloscope	Nihon kohden	VC-9	Display recorded discharge during
			experiment
Stereomicroscope	ZEISS	SV-11	Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator	Nihon kohden	SEZ-7203	Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair	Stoelting accompany		Delivery of the mechanical stimuli
Water bath	Scientz biotechnology Co., Ltd.	SC-15	Heating paroline to maintain at 37oC
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier	Axon Instruments	Multiclamp 700B	Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table	Optical Technology Co., Ltd.		Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera	Olympus	TH4-200	See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex	Axon	Clampex 9.2	Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit	Axon	Clampfit 10.0	Software for data analysis
Electrode puller	Sutter	P-97	Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette	Sutter	BF 150-75-10
Micromanipulator	Sutter	MP225	Give a precise control of the microelectrode
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin	Origin lab	Origin 8	Software for drawing picture
Perfusion Pump	BaoDing LanGe Co., Ltd.	BT100-1J	Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance	Sartorius	BS 124S	Weighing reagent
pH Modulator	Denver Instrument	UB7	Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Extracellular solution
Chloralose	Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.	M07752	Mixed solution for Anesthesia
Collagenase	Sigma-Aldrich	SLBQ1885V	Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Extracellular solution
Liquid Paraffin	TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.		Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911	Extracellular solution
Protease	Sigma-Aldrich	62H0351	Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5671	Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751	Extracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Extracellular solution
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Mixed solution for Anesthesia