Summary
마우스 유 방 땀 샘에서 개발 된 소기관을 조사 하 고 면역 세포와의 상피 특성과 상호 작용을 평가 하는 것을 특징으로 한다. 조사 된 유기 체는 조사 된 정상 조직에서 종양 세포 모집을 유도할 수 있는 세포-세포 상호작용을 더 잘 평가 하기 위해 사용 될 수 있다.
Abstract
소화 조직 으로부터 유래 된 오 르가 노이 드는 세포 단층 보다 생체 내 조건에서 더 잘 탈환 되는 다중 세포 3 차원 (3d) 구조 이다. 비록 그들은 완전히 생체의 복잡성을 모델링할 수 없습니다., 그들은 원래 장기의 일부 기능을 유지. 암 모델에서, 오 르가 노이 드는 일반적으로 종양 세포의 침략을 연구 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 정상 조직에서 방사선 반응을 평가 하기 위해 정상 및 조사 된 마우스 유선 조직에서 유기 체를 개발 하 고 특성화 하는 것을 목표로 합니다. 이러한 유기 oid는 방사선 조사 된 소기관과의 종양 세포 상호작용을 평가 하기 위해 미래의 시험관 내 암 연구에 적용 될 수 있다. 유 방 땀 샘은 절제 되었고, 20 Gy에 조사 되었으며, 콜라 게 나아 제 VIII 용액으로 소화 되었습니다. 상피 소기관은 원심 분화를 통해 분리 되었고, 3 차원 유기 체는 96-잘 저 접착 마이크로 플레이트에서 개발 되었다. 유기 oid는 특징적인 상피 마커 사이토 케 라틴 (14)을 발현 시켰다. 대 식 세포와 소기관 간의 상호작용은 공동 배양 실험에서 관찰 되었다. 이 모형은 종양 간 질 상호 작용, 면역 세포의 침 윤 및 조사 된 미세 환경 내에서의 대 식 세포 분극을 연구 하는 데 유용할 수 있습니다.
Introduction
삼중 음성 유방암 (TNBC)의 약 60% 환자는 치료1의 한 형태로 서 유 방 보존 요법 (bct)을 선택 한다. 이러한 치료 양상에서, 유 방 조직의 일부를 포함 하는 종양은 제거 되 고, 주변 정상 조직은 잔류 종양 세포를 죽이기 위해 이온화 방사선에 노출 된다. 치료는 유방암 인구의 다량에 있는 재발을 감소 시킵니다; 그러나 TNBC를 사용한 치료 대상 환자의 약 13.5%가 locoregional 재발2를 경험 한다. 따라서, 방사선은 순환 종양 세포를 모집 할 수 있는 방법을 연구 (ctcs) 로컬 재발에 대 한 중요 한 통찰력으로 이어질 것입니다3,4.
이전 작업에서는 정상 조직의 방사선이 다양 한 세포 유형5의 모집을 증가 시킨다는 것을 보여주었습니다. TNBC의 전 임상 모델에서 정상 조직에 대 한 대 식 세포 증가 및 후속 적 종양 세포의 조사는 정상 조직5에 관한 것 이다. 면역 상태는 조사 된 사이트에 종양 세포 모집에 영향을 미쳤다, 종양 세포 이동은 면역 손상 된 과목에서 관찰. 유 방 땀 샘에서 파생 된 오 르가 노이 드를 사용 하 여 이러한 상호 작용은 현미경 및 살아있는 세포 이미징을 통해 실시간으로 세포 이동 및 세포 간 질 상호 작용을 관찰 하 여 변경 시 방사선 손상의 역할을 결정할 수 있습니다. 종양 세포 행동.
마우스 유 방 소기관은 유선의 발달에서 주요 단계를 명료 하 게 도왔습니다. 유 방 소기관은 50 μm6,7,9,10보다 큰 고립 된 유 방 상피의 다중 세포, 3 차원 구조입니다. 1 차적인 상피 소기관을 사용 하 여, 시 미안 외. 유선에서 분기에 필요한 요인을 평가7. 샤미르 외. 확산은 중간 엽 전이에 상피 없이 발생할 수 있음을 발견, 전이성 캐스케이드에 대 한 통찰력을 제공8. 유선 조직 으로부터 유기 oid를 생성 하 고 특성화 하는 방법은 잘 확립 되어 있다6,11,12,13. 그러나, 우리의 지식에, 유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체를 성장 시키는 방법은 보고 되지 않았습니다. 조사 된 오 르가 노이 드의 성장 및 특성화를 위한 프로토콜은 방사선-유도 면역 및 종양 세포 모집을 탈환 하는 중요 한 단계 일 것 이다.
이 논문에서, 우리는 구상 된 유 방 상피 소기관의 성장 및 특성화를 위한 방법을 보고 하며,이는 구형 oid의 형성을 지 원하는 친수성 고분자로 코팅 된 저 밀착 마이크로 플레이트입니다. 이들 유기 체는 면역 세포 침투 동역학을 조사 하기 위해 대 식 세포와 공동 배양 하였다. 이 작업은 종양-면역 세포 상호 작용을 연구 하기 위해 종양 세포 모집 및 CD8 + T 세포를 가시화 하기 위해 유 방 특성, 유방암 세포를 다시 캡처하는 지방 세포와의 공동 배양을 포함 하도록 확장 될 수 있다. 이전에 확립 된 프로토콜은 조사 된 유기 체를 평가 하는데 사용 될 수 있다. 이전 모델은 유 방 소기관 및 면역 세포를 공동 배양 하 여 전이 및 보급 메커니즘에 빛을 발산 했습니다. DeNardo et al. 종양 관련 대 식 세포의 CD4 + T 세포 규제가 유 방 암 종의 전이성 표현 형을 향상시켰다는 것을 발견 하였다. 공동 배양 모델은 또한 생물학적 개발의 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 사용 되었습니다. Plaks et al. 유선의 다운 조정기로 서 CD4 + T 세포의 역할을 명확히 했다15. 그러나, 우리 그룹은 정상 조직 조사가 면역 세포 행동에 미치는 영향을 시각화 하는 절차를 확립 하는 첫 번째입니다. 정상 조직 조사는 종양 세포 모집5를 강화 하는 것으로 나타났습니다 때문에,이 프로토콜은 종양 세포 행동이 정상 조직과 세포의 조사에 의해 변경 되는 방법을 분석 하기 위해 추가로 개발 될 수 있기 때문에, 더 큰 이해를 선도 암 재발.
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Protocol
동물 연구는 밴 더 빌 트 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 제도적 지침 및 프로토콜에 따라 수행 되었습니다.
1. 쥐 및 세포 취득의 준비 (응 우 옌-옥 외11)
- 아 티 믹 Nu/Nu 마우스 (8-10 주)를 희생 하 여 자 궁 경부 탈 구가 이어지는 co2 질 식 사용. 70% 에탄올을 사용 하 여 피부를 청소 합니다.
- 사전 멸 균 된가 위 및 집게를 사용 하 여 쥐에서 복 부 및 사 타 구니 유 방 동맥을 절제 하십시오. 절제술 전에 림프절을 제거 하십시오. 멸 균 된 1x 인산 완충 식 염 수가 (도 1a)로 헹 궈 냅니다.
- Dulbecco의 변성이 글 미디어/영양 혼합물 10ML(DMEM/F12)를 사용 하 여 15 mL 튜브에 넣고 운반 하십시오. 샘플은 4°c에서 밤새 보관 하거나 즉시 처리 될 수 있다. 얼음을 계속.
- 세 슘 소스를 사용 하 여 20gy에서 샘플을 조사 합니다 (그림 1b).
- 조사 후 45 분이 지나면 유 방 땀 샘을 35 mm의 멸 균 셀 플레이트에 놓고 scalpels를 사용 하 여 다진에 놓습니다 (그림 1c, D). 약 40 획이 있는 mince는 조직이 이완 되 고 조각이 얻어질 때까지 약 1mm2 의 지역 보다 크지 않습니다.
- 50 mL 원심 분리기 튜브에 콜라 게 나아 제 용액으로 옮깁니다. 콜라 게 나아 제 용액은 2mg/ml의 콜라 게 나아 제 ( 물질 표참조), 2mg/ml의 태아 소 혈 청 (FBS), 5 μ g/m l 인슐린 및 50 μ g/m l의 겐 타 마이 신을 DMEM/F12 배지에서 구성 하였다. 마우스 당 10ml의 콜라 게 나아 제 용액을 사용 하십시오.
- 37 ° c의 수조에 넣고 10 분 간격으로 30-60 분 동안 볼 텍 싱 합니다. 콜라 게 나아 제 용액이 흐린 경우에는 소화가 완료 된다 (도 1e, F).
- 실 온 (RT)에서 10 분 동안 450 x g 의 소화 용액을 아래로 돌립니다. 세 개의 레이어가 관찰 됩니다. 상기 상층 액은 지방으로 구성 되 고, 중간층은 수 용액 이며, 바닥은 펠 렛 이다. 펠 릿은 상피 세포, 개별 기질 세포 및 적혈구의 혼합물로 서 적색으로 나타난다 (그림 1g).
- 접촉 하기 전에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 용액으로 모든 파이 펫, 피 펫 팁 및 원심 분리기 튜브를 미리 코팅 하십시오. BSA 솔루션은 Dulbecco의 인산 완충 식 염 액 (DPBS)에서 2.5% BSA로 구성 되어 있습니다. 사전 코팅을 위해, 단순히 다음 파이 펫 팁과 튜브의 내부에 BSA 솔루션을 제거 추가. BSA 솔루션을 재사용할 수 있습니다., 비록 그것은 각 실험 전에 멸 균 필터링 해야.
- 추가 회복을 위해, 상층 액을 신선한 BSA 코팅 15 mL 튜브로 전달 하십시오. 위 아래로 적극적으로 지방 층을 분산 하는 파이 펫. RT에서 10 분 동안 450 x g 에서 원심 분리기를 사용 하 여 상층 액을 흡입 하 여 세포 펠 렛을 흡입 하지 않도록 튜브에 소량의 배지를 남깁니다.
- 원래 펠 릿 튜브에서 수성 층을 흡입.
- 원래 펠 렛으로 튜브에 10ml의 DMEM를 넣고 두 번째 튜브로 이동 합니다. 파이 펫은 두 개의 펠 릿을 결합 하 고 소생 시킵니다.
- RT에서 10 분 동안 450 x g 에서 원심 분리기를 통해 상층 액을 흡입 하 고 튜브에 DMEM/F12를 추가 합니다.
- 40 μ l (DNase)을 현 탁 액에 추가 하 고 deoxyribonuclease에서 2-5 분 동안 손으로 부드럽게 흔들어 DMEM/F12에서 4U/mL DNase로 구성 됩니다.
- DMEM/F12 및 파이 펫 6 mL을 철저히 추가 하십시오. RT에서 10 분 동안 450 x g 에서 튜브를 원심 분리기.
- 0.5 mL 마크에 상층 액을 흡입. 10ml의 DMEM 및 피 펫에 완전히 소생 시킵니다.
- 450 x g 에 펄스를 하 고 그 속도에 도달 하면 4 초를 중지 합니다.
- 1.16-1.17 단계를 3 회 더 반복 하 여 원심 분화를 통해 소기관을 정화 합니다. 펠 릿은 이제 상피 소기관 으로만 구성 된 오프 화이트 색상 이어야 합니다 (그림 1h).
참고: 유기 Oid는 멸 균 메시 40 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 할 수도 있습니다. 1.16 단계 후, 필터를 통해 유기 oid를 포함 하는 피 펫 배지를 원심 분리기 튜브에 넣고, 5 내지 10ml의 DMEM/F12 배지로 헹 궈 냅니다. 새로운 50 mL 원심 분리기 튜브 위로 필터를 뒤집습니다. DMEM/F12 미디어 10ml를 통과 하 여 그 반대 방향으로 헹 궈 냅니다. 리 텐 테이 트는 오 르가 노이 드로 구성 되어야 하며, 여 액은 주로 폐기 되거나 원할 경우 보관할 수 있는 기질 세포로 구성 되어야 합니다.
2. 밀도 및 도금 유기 oid 결정
- 10MlDMEM/F12에서의 소생 펠 렛. 완벽 하 게 균질 한 용액을 만듭니다.
- 50 µ L을 30 mm 페 트리 디쉬로 전송 하 고, 위상차 현미경을 20x로 볼 수 있습니다. 집계 카운터를 사용 하 여 소기관 수를 셉니다.
참고: 여기에서 피 펫 팁은 457 μ m의 최소 지름과 함께 일관 되 게 사용 되었으며,이는 시드 된 소기관의 지름 5-10 배입니다. 2 mL 이상의 부피를 전송 하는 경우 (예: 1.16 및 2.1 단계), 팁 직경이 1500 μ m를 초과 하는 혈 청 피 펫을 사용 하십시오. - 다음 방정식을 사용 하 여 관 능 밀도를 계산 합니다.
원하는 밀도는 1000 유기 체/m l은 추가 희석을 단순화 합니다. 밀도가 너무 낮으면, 5 분 동안 450 x g 에서 원심 분리 하 고 미디어를 흡 인 한다. 1000 유기 체/m l에 도달 하는 데 필요한 매체를 추가 하 고 균질 한 혼합물을 생성 하기 위해 피 펫을 철저히 합니다.- 단백질 매트릭스에서 오 르가 노이 드를 성장 시키기 위해, 콜라겐 유형 1에서 1 개의 세포/L의 농도로 씨앗 소기관을 87%로 희석 하 고, 엥 겔 브 스-홀 름-군단의 쥐 육 종에서 추출한 지 하 막에서 추출 하였다. 샘플로 작업 하는 동안 얼음을 유지 하십시오.
- 소기관을 동결 하려면 원하는 체적을 별도의 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 450 x g 에서 5 분 동안 스핀 다운 하 여 미디어를 흡 기 한 다음 동일한 부피의 90% FBS을 추가 합니다. 유기 체를 소생 시킨 다음, 동결 튜브로 분해 합니다. -80 ˚ C로 이동한 다음 1 주일 이내에 액체 질소로 전송 합니다.
- 해 동 하려면, 37 ˚ C 수 조에서 1 분간 따뜻하게 하 고, 5 분간 450 x g 에서 원심 분리 한 다음, 동결 매체를 흡 인 한다. 멸 균 된 DPBS로 헹 군 다음 다시 원심 분리기. DPBS를 흡입 하 고 소기관 매체를 추가 합니다.
- 피 펫 50 µ L (50 소기관)을 저 밀착 판의 각 웰에 투입 한다 (그림 1i).
- 150의 µ L을 추가 하 여 총 작업 볼륨을 200 µ l. 유기 체 미디어는 DMEM/F12 미디어에서 1% 페니실린 streptomycin 및 1% 인슐린 트랜스 페 린 셀레늄으로 구성 됩니다.
- 이틀 마다 미디어를 주의 해 서 교체 하십시오.
참고: 낮은 접착 판은 조직 배양 처리 되지 않습니다; 따라서, 세포는 쉽게 분리 될 수 있다. 플레이트를 기울여 각 웰의 가장자리에 파이 펫 팁을 삽입 하 여 미디어를 천천히 흡입 합니다. 우물의 바닥에 소량의 매체를 남겨 두십시오. 새 미디어를 천천히 추가 하 여 유기 체에 불필요 한 전단 력을 적용 하지 않도록 합니다.
3. 대 식 세포와의 공동 배양
- 10% FBS 및 1% 페니실린 streptomycin로 보충 되는 DMEM 매체에 있는 GFP 또는 dTomato-라벨링 된 원시 264.7 대 식 세포를 유지 하십시오. 종자 1 x 104×104 또는1 x 105 세포/ m l을 관 능 적 매체에 투입 한다.
- 살아있는 세포 상 대조 및 형광 성 화상 진 찰을 사용 하 여 시간에 따른 대 식 세포 침투를 모니터링 합니다.
4. 유기 oid의 면역 형광 염색
참고: 유기 Oid는 낮은 접착 웰에 얼룩이 있거나 챔버 슬라이드로 옮길 수 있습니다. 전달 하려면, 유기 체를 접시에서 분리할 때까지 부드럽게 발라 주세요. 챔버 슬라이드에 전송 하 고 4-8 h에 대 한 배양을 통해 유기 oid가 플레이트 표면에 부착 되도록 합니다.
- 조심 스럽게 흡입 하 여 우물에서 소기관 매체를 제거 합니다. RT에서 15 분 동안 10% 중성 완충 포 르 말린으로 샘플을 수정 합니다.
- PBS 1 개에서 3x 5 분을 씻으십시오. 원하는 경우, 고정 된 샘플은 추가 염색을 위해 1 주일 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.
- 5 분 동안 0.1%의 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜과의 투과와 Tetramethylbutyl.
참고: 액 틴에 대 한 얼룩을 위해 phalloidin 희석 1:1000 및 1.67 nM의 비 벤 제 이미 드 핵 염료를 RT에서 1 시간 동안 1% PBS/BSA에서 시료를 배양 합니다. 그런 다음 4.8 단계로 진행 합니다. - 0.5 PBS와의 가용성. 샘플은 4opy 이미지와 면역 형광 이미지에 저장할 수 있습니다. 0.1%의 정상 염소 혈 청으로 CTC rlock에 기여 하는 기계 장치 RT에서 1 시간 동안 pbs/폴 리 에틸렌 글리콜 소 르 비 탄 monolaurate (PBST)를 사용 하 여 3 ~ 5 분.
- 항 사이토 케 라틴 (14) 희석, 전자 Cadherin 희석 1:200 또는 타이트 접합 단백질을 RT에서 1 시간 동안 PBST에서 1% NGS로 희석 1:100을 사용 하 여 PBST에서 3x 5 분간 씻으십시오.
- RT에서 1 시간 동안 1% NGS/PBST의 염소 반 토끼 2 차 희석 1:200으로 배양 합니다. 빛 노출을 피하기 위해 호 일 커버.
- PBS에서 3 배 5 분간 씻으십시오. 핵 염료 ( 재료 표참조)를 사용 하 여 핵 염색을 합니다.
- PBS에서 3 배 5 분간 씻으십시오. 챔버 슬라이드를 사용 하는 경우 커버 슬립으로 장착 하십시오. 4 ° c에서 최대 2 주 동안 포 일에 싸서 보관 하십시오.
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Representative Results
조사 된 상피 유선 유기 체는 마우스 유 방 땀 샘에서 성공적으로 장악 되 고, 처리 되 고, 저 접착 판에서 배양 되었습니다 (그림 1). 오 르가 노이 드 수율은 상이한 성장 환경에서 시 딩에 의해 시험 되었다 (도 2Ag). 10 cm 세포 판을 처리 한 조직 배양 물에 직접 세포를 파 종 하는 것은 섬유 아 세포의 자라 난을 산출 했습니다. 섬유 아 세포는 유기 체와 같은 초점의 동일 평면에 또는 가까운 상 대조 현미경에서 확인 되 고, 그들은 며칠 안에 도금 된 소기관에서 빨리 성장 했습니다. 섬유 아 세포의 성장 또한 지 하 막 및 콜라겐 단백질 매트릭스에서 소기관 될 때 관찰 되었다 (도 2e, F).
조사 된 소기관 성장을 최적화 하기 위해 다양 한 조건이 테스트 되었습니다 (그림 2h). 콜라 게 나아 제 유형 I 및 VIII-클로스 트리 디 움 역사 에서의 효소는 소기관 소화단계12,17에 사용 하였다. 유기 체 수율은 콜라 게 나 제 VIII로 소화 후 상당히 더 높게 하였다. 이것은 효소를 제조 하는 데 사용 되는 정제 과정에 기인 할 수 있다: 콜라 게 나아 제 타입 I는 부분적으로 정제 되 고 막 단백질 및 수용 체에 불필요 한 손상을 야기할 수 있으며, 불량 한 소기관 형성, 세포 용 해 또는과 소화16 , 17 , 18. 조사 되 고 대조 된 유기 체 사이의 수율에 현저한 차이가 관찰 되지 않았다.
조사 된 유기 체는 낮은 접착 판 (도 3a ~ C) 또는 지 하 막 내에서 배양 될 수 있었다 (도3d-g), 낮은 접착 판에서 발생 한 가장 급속 한 성장 (도3h). 오가 노이 드는 유선의 특징을 다시 캡처합니다. 흰색 화살촉은 유선21에서 우유를 생산 및 운반 하는 데 중요 한 덕트 및로 브19, 20,21 (그림 3c)과 형태학 적으로 유사한 구조를 나타냅니다. 그러나,이 관측을 확인 하기 위해 추가 특성화가 필요 합니다. 성장 추세는 조사 되지 않은 소기관이 조사 된 유기 체 (도 3h) 보다 더 빠르게 성장 했다는 것을 나타내 었으 며, 대부분의 경우 DNA 손상 복구의 메카니즘으로 인 한 세포 성장 체포로 인해; 그러나, 경향은 통계적으로 유의 한22아니었다. 낮은 유착 성 유기 체의 간헐적 응집이 관찰 되었고, 유기 oid는 해리 되기 전에 최대 2 주까지 배양 될 수 있었습니다.
소기관은 상피 특성을 발현 하 고, 사이토 케 라틴 K14)의 면역 형광 염색을 통해 평가 하였으며,이를 통해 타이트 한 접합 단백질 1(zo),24,25 ( 그림 4). 조사 된 유기 체는 상피 마커를 나타냈다. K14, myoepithelium (23)의 마커는 조사 된 소기관의 표면에 강하게 발현 되었다 (도 4a). 또한, 전자 캐 드 및 조-1은 소기관의 세포 접합 내에서 발현 되었다 (도 4b, C). 이 단백질은 적당 한 세포 접착성24를 위해 필수적입니다. 조사 후, 유기 체는 그들의 상피 특성을 계속 유지 했다.
유기 oid의 형광 염색은 형광 현미경을 사용 하 여 낮은 접착 판 내에서 가시화 될 수 있었다 (도 5a-D); 그러나, 공초점 현미경 (도 5e-F)을 통해 선명한 가시화가 얻어진 다. 보정 된 총 형광 강도는 유기 체 영역에 의해 정규화 된 배경을 뺀 값으로 계산 하였다 (도 5g). 96의 성장 유기 체-잘 낮은 접착 판은 또한 공동 배양 실험을 단순화 시켰다. 유선에서 전형적으로 농도에서 시 딩 될 때, 대 식 세포는 대조 및 조사 된 유기 체와 공동으로 국 소화 된다 (그림 6)24,26.
그림 1입니다. 메서드 워크플로. (A) 유 방 땀 샘은 생쥐 로부터 절제 되었습니다. 복 부 및 사 타 구니 유 방 땀 샘이 사용 되었습니다. (B) 유 방 땀 샘은 DMEM/F12 배지를 포함 하는 50 mL 원심 분리기 튜브에 조사 되었다. (C) 유 방 땀 샘은 멸 균 된 6 웰 플레이트에 옮겨 지 고 다진 후에 수술 용 scalpels로 절단 했습니다 (D). (E) 유 방 땀 샘은 50 ml의 원심 분리기 튜브에 DMEM 배지 당 5 ml의 멸 균을 함유 하 고, 콜라 게 나아 제 VIII 용액 (F)에서 분해 하였다. (G) 15 mL 튜브로 이송 된 후, 원심 분화를 활용 하 여 기질 세포, 단 세포 및 적혈구를 제거 하 고 백색 상피 계 소기관만을 얻을 때까지 적색 펠 렛 (백색 화살표 머리)에서 관찰 하였다 (H ). (I). 50 유기 체는 96의 매체의 200 µ l에 도금 되었습니다-잘 낮은 접착 판 및 위상 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지화 한 가늠 줄은 50 µm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 3 차원 단백질 매트릭스 및 조직 배양 처리 된 플라스틱에서의 소기관 도금. 유기 체는 콜라겐 (A) 및 지 하 막 (B)에서 시 딩 되 고 84 시간 후에 이미징 됩니다. 섬유 아 세포의 성장이 매트릭스 도금 된 유기 체 (C, D)에서 발생 하였다. 여과를 통해 분류 된 소기관의 상 대조 이미지는 시 딩 후 192 시간 동안 얻었다. 여 액 (E)과 리 텐 테이 트 (F) 사이에 큰 차이가 관찰 되지 않았고, 두 가지 모두는 매끄러운 섬유 아 세포 성장을 초래 하였다. E 및 F 의 세포는 조직 배양 처리 된 플라스틱에 시 딩 되었다. RT에서 5 분 동안 trypsinizing 후, 섬유 아 세포는 흡 인을 통해 제거 되었다; 그러나, 잔류 상피 세포는 3 차원 유기 oid (G) 대신 단층 배양을 형성 하였다. A-G 에 대 한 축척 막대는 100 µm을 나타냅니다. 다양 한 콜라 게 나아 제 유형 (CI 및 viii) 및 세포 처리 방법 (여과 및 원심 분화 (센트 차이)을 시험 하였으며, 유선 당 오 르가 나 수율은 (CI, 필터에 대 한 n = 2 동맥; CVIII, 필터에 대 한 2 동맥; CI, 센트 차이에 대 한 4 개의 동맥 및 CVIII, 센트 Diff에 대 한 12 개의 동맥. 통계적 유의 성은 2 꼬리, 짝이 없는 t 검정을 사용 하 여 결정 하였다 < 0.0001. 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 대표적인 소기관 성장. 낮은 접착 판에서 조사 된 관 능 성 성장의 위상차 이미지는20(a), 44)및 시 딩 후 106 (C) 시간을 얻었다. 흰색 화살촉은 덕트 및로 브와 유사한 형태학을 가진 구조물을 나타냅니다. 지 하 막에서 조사 된 소기관 성장의 상 대조 이미지 42 (D), 66, 60및 114 (G)시간 시드 후에 얻어진 다. 축척 막대는 50 µm을 나타냅니다. 영역 측정은 상이한 성장 조건에서 얻어 졌다: 소화 및 선별 후에 즉시 시 딩 된 오 르가 노이 드 (● ▪)를 조사 하 고, 지 하 막에 형성 된오 르가 노이 드를 제어 한다 (□) 땀 샘). 영역 계산은 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 만들어졌다. 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 조사 된 유기 체에 상피 마커 발현. 세포 각 질 14 (K14, 녹색), 편평 상피 및 비 편평 상피의 기저 층에 대 한 마커가 조사 된 유기 체 (a) 상에 발현 되었다. 접착에 필수적인 단백질 인 e-카 데로 (E-Cad)는 조사 된 유기 체 (B)에서 세포 사이의 접합부 내에서 발현 되었다. 타이트 한 접합 단백질 1 (ZO)은 또한 조사 된 유기 체 (C)의 세포 접합 체 내에서 발현 되었다. 공초점 현미경을 통해 챔버 슬라이드에서 이미지를 얻었다. 핵 산 얼룩은 핵 (청색)을 가시화 하는 데 사용 되었다. 모든 오가 노이 드는 성장 1 주일 후에 고정 및 이미징 되었습니다. 축척 막대는 50 µm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 액 틴 발현. 액 틴 (적색), 상피 세포에서 마이크로 필 라 멘 트를 조사 하 여 비 조사 된 오 르가 노이드(a, C) 내에 더 낮은 강도로 발현 하였다. 핵 산 얼룩은 핵 (청색)을 가시화 하는 데 사용 되었다. 이미지는 낮은 접착 력 96 웰 플레이트 (A, B) 및 16 웰 챔버 슬라이드 (C, D)에서 촬영 되었다. 이미지는 또한 공초점 현미경 (E, F)을사용 하 여 촬영 하였다. 모든 오가 노이 드는 성장 1 주일 후에 고정 및 이미징 되었습니다. 축척 막대는 50 µm입니다 . 낮은 접착 판 이미지 로부터의 phalloidin 형광 데이터는 ImageJ에서 정량화 되었다 (n = 3 분 비선). 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 대 식 세포-관 능 공동 배양을 통한 셀-세포 상호작용 평가. 대 식 세포 (적색)가 침투 된 대조 군 (a) 및 조사된(B) 소기관. 눈금 막대는 50 μ m를 나타냅니다. 영상 분야에서 대 식 세포의 평균 퍼센트 면적 (C)은 24 시간 동안 대조 군 (황색) 및 조사 된 오 르가 노이 드 (각 시료에 대해 n=3)의 공동 배양을 보고 하였다. 대 식 세포는 1만 셀/m l, 5만 세포/m l 및 10만 세포/m l의 농도에서 시 딩 되었고, 그들의 침투는 살아있는 세포 형광 이미징을 통해 30 분 마다 포획 되었다. 모든 공동 배양 실험은 초기 소기관 시드 후 7 일 후에 개시 되었다. 통계적 유의 성은 2 꼬리, 짝이 없는 t 검정, * p < 0.05를 사용 하 여 결정 되었다 < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 조사 된 유 방 유기 체의 성장 및 특성화를 재현 하기 위한 방법을 개발 했습니다 (그림 1). 20gy의 조사 량은 종양 세포 모집5의 생체 내 모델 이전에 거울에 적용 되었다. 유 방 땀 샘의 조사는 생체 내 형성 이전에 면역 세포의 상응 하는 침 윤 없이 방사선 손상 효과의 분리를 허용 하였다. 시험관 내 조사 된 정상 조직 모델의 개발은 방사선 유도 CTC 모집11,12에 기여할 수 있는 세포 상호작용의 실시간 시청을 가능 하 게 한다.
오 관 능 수율을 극대화 하기 위해 1.5-1.18 단계를 밀접 하 게 수행 하는 것이 중요 했습니다. 우리는 소화 용액에 농축 된 콜라 게 나아 제를 해 동 하는 것을 추가 했습니다. 농축 된 콜라 게 나아 제 분 취의 고 점성 성질로 인해, 양 및 효소 활성에 있어서 약간의 변형이 있을 수 있으므로과 소화를 피하기 위해 소기관 소화를 면밀히 모니터링 해야 합니다. 이는 소화를 위한 고른 표면적을 허용 하므로 50 mL 튜브에서 유기 oid를 소화 하는 것도 중요 합니다. 다른 연구 들은 유기 체19,23을 정화 하기 위해 여과를 사용 하였다; 그러나 우리는 원심 분화로 훨씬 더 높은 수율의 정제를 얻었다 (그림 2h). BSA 솔루션을 사용 하는 사전 코팅 파이 펫, 파이 펫 팁 및 원심 분리기 튜브는 수율을 극대화 하는 데 필수적입니다. 유기 체는 용액 적용을 소홀히 할 때 비 코팅 플라스틱을 현저 하 게 준수 합니다.
유기 체를 흡입 하지 않도록 주의 해야 합니다. 이것은 형광 마커에 대 한 정제, 변화 매체 및 염색 시 발생 하는 위험입니다. 성장을 위한 낮은 접착 판을 사용 하 여 오 르가 노이 드의 용이한 전달을 가능 하 게 하 고 추가의 염색을 위해 OCT에서 단면화 될 소기관에 대 한 필요성을 제거 하 여, 지 하 막 임베디드 오 르가 노이 드11에 필요한 절차를 수행할 수 있다. 우수한 성장 으로부터의 이점 외에도, 낮은 접착 판에서 조사 된 오 르가 노이 드가 적은 단계를 필요로 하 고 지 하 막 또는 콜라겐에서 오 르가 노이 드를 배양 하는 것 보다 기술적으로 덜 도전 하였다. 그러나 마커를 염색 할 때 우발적 인 열망이 생기지 않도록 현미경으로 유기 체를 보는 것이 도움이 될 수 있습니다.
또한, 유기 oid를 이미징 할 때 고려해 야 할 많은 고려 사항이 있습니다. 지 하 막 임베디드 소기관 내에서, 간헐적인 섬유 아 세포 성장이 관찰 될 수 있다 (도 2c, D). 3 차원 배양 된 소기관에서의 섬유 아 세포의 성장은 조직 배양 처리 표면과 접촉 하는 오 르가 노이 드에 의해 야기 될 수 있으며 유착은 부착 세포 (27)에서 상향 조절 된 섬유 아 세포 성장 인자 생산으로 이어진다. 흥미롭게도, 이들 섬유 아 세포의 형태학은 두 세포 형이 가늘고, 길쭉한 모양 (28)을 전시 함에 따라 지방 세포와 현저 하 게 유사 하다. 추가 조사에서, 인슐린에 대 한 노출, 덱 사 메타 손 및 3-이 소부 틸 제 (IBMX)는 지방 분화로 세포를 생성 할 수 있으며, 지방 세포와 관련 된 구형 세포 모양으로의 전환을 촉진 하 고, 29. 우리는 자유로운 성장 하는 낮은 접착 (그림3a-c) 및 지 하 막 임베디드 (그림 3dg) 소기관의 위상 대조 현미경을 사용 하 여 선명한 이미지를 얻었습니다. 그러나 낮은 접착 판에서의 개별 소기관 성장을 추적 하는 것은 세포와 표면 간의 초점 유착을 최소화 하 여 오 르가 노이 드 운동과 간헐적 인 포부를 초래 하는 것이 어려웠습니다.
일단 표면 표식에 대해 염색 되 면, 공초점 현미경은 와이드 필드 현미경 보다 명확 하 게 마커 국 소화 (그림 5e, F)를 렌더링 했습니다. 형광 정량화에서, phalloidin 발현의 동향은 조사 된 유기 oid가 대조 군에 비해 증가 된 액 틴을 발현 하는 것을 시사 한다 (도 5g). 액 틴 세포 골격 재구성은 유사한 투여 량 (30)에서 조사 된 피부 미세 혈관 내 피 세포에서 관찰 되었다.
면역 세포와의 타임 랩 스 공동 배양과 같은 확장 된 이미징 서 열의 경우 (도 6), 습도 및 co2 제어를 가진 살아있는 세포 이미징 챔버 (31)가 필요 하다. 30 분 마다 촬영 된 살아있는 세포 화상은 24 시간 (도 6a, B) 이후에 오 르가 노이 드와 함께 대 식 세포와 공동으로 국 소화 된 것으로 밝혀 지 며, 조사 된 유기 체를 우선적으로 이동 한다 (도 6c). 조사 된 정상 조직 내로의 대 식 세포 침 윤은 생체 내에서 관찰 되었으며, 케 모카 인 및 사이토카인 구배에 기인 하며, 통상적으로 CTC 채용5를 선행 한다. 미래 연구는 고전적이 고 대안적으로, 유기 체와의 대 식 세포 상호 작용을 편광 된 대 식 세포 역학으로 평가할 것 이며, 방사선32,33에 대 한 반응을 결정 하는데 중요 한 역할을 할 수 있다. 추가 분석은 이러한 변수들이 소기관 면역 세포 상호 작용에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 혈 청 기아 및 완전 한 배지에서 유기 노이 드 배양의 성장 효과의 결과를 평가할 것 이다. 이 시스템은 CD8 + T 세포를 포함 한 다른 세포 유형과의 공동 배양을 위해 추가로 적응 될 수 있다, 기질 세포, 지방 세포내, 및 유방암 세포. 살아있는 세포 화상 진 찰과 같은 기술을 가진 실시간 관측은 재발을 앓고 있는 환자를 위해 중요 한 연루가 있을 수 있는 조사 된 정상 조직에 CTC 모집에 기여 하는 잠재적인 기계 장치의 해명을 촉진 합니다 TNBC.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 GFP와 dTomato 표지 된 원시 264.7 대 식 세포를 제공 하는 닥터로 라 l. 브 론 사르 감사 합니다. 이 연구는 재정적으로 NIH 그랜트 #R00CA201304에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
References
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H.
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
- Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S.
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
