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Bioengineering

Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59293
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Les organoïdes développés à partir de glandes mammaires de souris ont été irradiés et caractérisés pour évaluer les traits épithéliaux et les interactions avec les cellules immunitaires. Les organoïdes irradiés peuvent être utilisés pour mieux évaluer les interactions de cellules cellulaires qui peuvent conduire au recrutement de cellules tumorales dans le tissu normal irradié.

Abstract

Les organoïdes dérivés du tissu digéré sont des constructions tridimensionnelles (3D) multicellulaires qui mieux récapitulent les conditions in vivo que les monocouches cellulaires. Bien qu’ils ne puissent pas complètement modéliser la complexité in vivo, ils conservent certaines fonctionnalités de l’orgue d’origine. Dans les modèles de cancer, les organoïdes sont couramment utilisés pour étudier l’invasion de cellules tumorales. Ce protocole vise à développer et caractériser les organoïdes du tissu de la glande mammaire de souris normale et irradiée pour évaluer la réponse de rayonnement dans les tissus normaux. Ces organoïdes peuvent être appliqués à de futures études de cancer in vitro pour évaluer les interactions des cellules tumorales avec des organoïdes irradiés. Les glandes mammaires ont été retouchées, irradiées à 20 Gy et digérées dans une solution de collagénase VIII. Les organoïdes épithéliaux ont été séparés par une différenciation centrifuge, et des organoïdes 3D ont été développés dans des microplaques à faible adhérence à 96 puits. Les organoïdes ont exprimé la cytokératine du marqueur épithélial caractéristique 14. L’interaction macrophage avec les organoïdes a été observée dans des expériences de co-culture. Ce modèle peut être utile pour étudier les interactions tumeur-stromale, l’infiltration des cellules immunitaires et la polarisation des macrophages dans un microenvironnement irradié.

Introduction

Environ 60% des patients atteints de cancer du sein à triple négatif (TNBC) choisissent une thérapie de conservation du sein (BCT) comme forme de traitement1. Dans cette modalité de traitement, la tumeur contenant une partie du tissu mammaire est enlevée, et le tissu normal environnant est exposé aux rayonnements ionisants pour tuer les cellules tumorales résiduelles. Le traitement réduit la récurrence dans une grande partie de la population de cancer du sein; Cependant, environ 13,5% des patients traités par TNBC éprouvent des récidives locorégionales2. Par conséquent, étudier comment le rayonnement peut recruter des cellules tumorales circulantes (CTCS) mènera à des aperçus importants sur la récurrence locale3,4.

Des travaux antérieurs ont montré que le rayonnement du tissu normal augmente le recrutement de divers types de cellules5. Dans les modèles précliniques de TNBC, l’irradiation du tissu normal augmentait le macrophages et subséquemment le recrutement des cellules tumorales dans les tissus normaux5. Le statut immunitaire a influencé le recrutement des cellules tumorales sur les sites irradiés, avec la migration des cellules tumorales observée chez les sujets immunodéprimés. La récapitulation de ces interactions à l’aide d’organoïdes dérivés de glandes mammaires permettra l’observation de la migration cellulaire et des interactions cellules-stromales en temps réel avec la microscopie et l’imagerie cellulaire en direct afin de déterminer le rôle des dommages causés par les radiations lors de l’altération comportement des cellules tumorales.

Souris mammaires organoïdes ont contribué à élucider les étapes clés dans le développement de la glande mammaire. Un organoïde mammaire est une construction multicellulaire en trois dimensions de l’épithélium mammaire isolé qui est plus grand que 50 μM6,7,8,9,10. À l’aide d’organoïdes épithéliaux primaires, Simian et coll. ont évalué les facteurs nécessaires à la ramification dans la glande mammaire7. Shamir et coll. ont découvert que la dissémination peut se produire sans transition épithéliale à médéchymateuses, ce qui donne un aperçu de la cascade métastatique8. Les méthodes de production et de caractérisation des organoïdes du tissu de la glande mammaire sont bien établies6,11,12,13. Cependant, à notre connaissance, les méthodes de croissance des organoïdes irradiés des glandes mammaires n’ont pas été rapportées. Un protocole pour la culture et la caractérisation des organoïdes irradiés serait une étape cruciale dans la récapitulation du recrutement immunitaire et des cellules tumorales induite par le rayonnement.

Dans cet article, nous rapmettons une méthode pour cultiver et caractériser les organoïdes épithéliaux mammaires irradiés dans des microplaques à faible adhérence recouvertes d’un polymère hydrophile qui soutient la formation de sphéroïïdes. Ces organoïdes ont été co-cultivés avec des macrophages pour examiner la cinétique d’infiltration des cellules immunitaires. Ce travail peut être étendu pour inclure les organoïdes de co-culturing avec les cellules adipeuses pour récapituler les caractéristiques mammaires, les cellules cancéreuses du sein pour visualiser le recrutement de cellules tumorales, et les cellules de T + + T pour étudier les interactions de cellules de tumeur-immunes. Des protocoles préalablement établis peuvent être utilisés pour évaluer les organoïdes irradiés. Les modèles antérieurs co-culturant les organoïdes mammaires et les cellules immunitaires ont mis en lumière les mécanismes de métastase et de dissémination. DeNardo et coll. ont constaté que la régulation des lymphocytes T CD4 + des macrophages associés aux tumeurs a amélioré le phénotype métastatique des adénocarcinomes mammaires14. Des modèles de co-culture ont également été utilisés pour élucider les mécanismes de développement biologique. Plaks et coll. ont clarifié le rôle des lymphocytes T CD4 + comme régulateurs de bas de l’organogenèse mammaire15. Cependant, notre groupe est le premier à établir une procédure de visualisation de la façon dont l’irradiation tissulaire normale influe sur le comportement des cellules immunitaires. Parce que l’irradiation normale des tissus a été montré pour améliorer le recrutement de cellules tumorales5, ce protocole peut être développé pour analyser comment le comportement des cellules tumorales est altéré par l’irradiation des tissus normaux et des cellules, conduisant à une meilleure compréhension de récidive du cancer.

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Protocol

Des études sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives et protocoles institutionnels approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt.

1. préparation des souris et acquisition de cellules (adapté de Nguyen-Ngoc et al.11)

  1. Sacrifiez des souris nu/nu athymiques (8-10 semaines) en utilisant l’asphyxie du CO2 suivie d’une dislocation cervicale. Nettoyez la peau à l’aide de 70% d’éthanol.
  2. Resect glandes mammaires abdominales et inguinaux de souris à l’aide de ciseaux pré-stérilisés et forceps. Enlevez les ganglions lymphatiques avant la résection. Rincer dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) (figure 1a).
  3. Placez-le dans des tubes de 15 mL avec 10 mL de mélange de milieux/nutriments de Dulbecco modifié Eagle F12 (DMEM/F12) pour le transport. Les échantillons peuvent être conservés pendant la nuit à 4 ° c ou traités immédiatement. Continuez sur la glace.
  4. Irradier des échantillons à 20 Gy à l’aide d’une source de césium (figure 1b).
  5. 45 min après irradiation, placer les glandes mammaires dans une plaque de cellule stérile de 35 mm et émincer avec des scalpels (figure 1c, D). Hacher avec environ 40 coups jusqu’à ce que le tissu se détend et que les morceaux soient obtenus qui ne sont pas plus grands que approximativement 1 mm2 dans la zone.
  6. Transférer à la solution de collagénase dans un tube de centrifugation de 50 mL. La solution de collagénase se compose de 2 mg/ml de collagénase (voir tableau des matériaux), de 2 mg/ml de trypsine, de 5% v/v de sérum bovin fœtal (FBS), de 5 μg/ml d’insuline et de 50 μg/ml de gentamicine dans les milieux DMEM/F12. Utilisez une solution de collagénase de 10 mL par souris.
  7. Placer dans un bain d’eau à 37 ° c, Vortex toutes les 10 min pour 30-60 min. la digestion est complète lorsque la solution de collagénase est trouble (figure 1e, F).
  8. Faire tourner la solution digéré à 450 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). Trois couches seront observées. Le surnageant est composé de graisse, la couche intermédiaire est une solution aqueuse, et le fond est un culot. Le culot apparaîtra en rouge car il s’agit d’un mélange de cellules épithéliales, de cellules stromales individuelles et de globules rouges (figure 1g).
  9. Préenduire toutes les pipettes, pointes de pipette et tubes à centrifuger avec une solution d’albumine sérique bovine (BSA) avant le contact. La solution BSA se compose de 2,5 w/v% de BSA dans le sérum physiologique tamponné au phosphate de Dulbecco (DPBS). Pour le pré-enrobage, il suffit d’ajouter puis de retirer la solution BSA à l’intérieur de la pointe de la pipette et des tubes. La solution BSA peut être réutilisée, bien qu’elle doive être filtrée stérile avant chaque expérience.
  10. Pour une récupération supplémentaire, transférer le surnageant dans un tube de 15 mL frais recouvert de BSA. Pipetter de haut en bas vigoureusement pour disperser la couche grasse. Centrifugez à 450 x g pendant 10 min à la RT. aspirate le surnageant, laissant une petite quantité de médias dans le tube pour éviter d’aspirer le culot de la cellule.
  11. Aspirer la couche aqueuse du tube avec le culot d’origine.
  12. Ajouter 10 mL de DMEM/F12 au tube avec le culot d’origine et le transférer dans le deuxième tube. Pipetter vigoureusement pour combiner et Resuspendre les deux pastilles.
  13. Centrifuger à 450 x g pendant 10 min à RT. aspirer le surnageant et ajouter 4 ml de DMEM/F12 au tube.
  14. Ajouter 40 μL de désoxyribonucléase (DNase) à la suspension et agiter doucement à la main pendant 2-5 min à la solution RT. DNase se compose de 4 U/mL de DNase dans le DMEM/F12.
  15. Ajouter 6 mL de DMEM/F12 et Pipetter soigneusement. Centrifuger le tube à 450 x g pendant 10 min à RT.
  16. Aspirate surnageant à la marque de 0,5 mL. Résuspendez dans 10 mL de DMEM/F12 et Pipettez soigneusement.
  17. Impulsion à 450 x g et arrêt 4 s après avoir atteint cette vitesse.
  18. Répétez les étapes 1.16-1.17 trois fois de plus pour purifier les organoïdes par différenciation centrifuge. Le culot doit maintenant être une couleur blanc cassé composée uniquement d’organoïdes épithéliaux (figure 1H).
    Remarque: les organoïdes peuvent également être filtrés à l’aide de filtres à mailles stériles 40 μm. Après l’étape 1,16, les milieux de pipette contenant des organoïdes dans un filtre dans un tube de centrifugation, puis rincer avec 5 à 10 mL de support DMEM/F12. Retournez le filtre sur un nouveau tube à centrifuger de 50 mL. Passez 10 mL de média DMEM/F12 à travers, en allant dans le sens inverse pour rincer tout retentate. Le rétentat doit consister en organoïdes, et le filtrat doit se composer principalement de cellules stromales, qui peuvent être jetées ou conservées si désiré.

2. détermination des organoïdes de densité et de placage

  1. Resuspendre le pellet dans 10 mL de DMEM/F12. Pipetter soigneusement pour créer une solution homogène.
  2. Transférer 50 μL dans une boîte de Petri de 30 mm et voir sous un microscope à contraste de phase à 20x. Comptez le nombre d’organoïdes avec un compteur de décompte.
    Remarque: ici, les pointes de pipette ont été systématiquement utilisées avec un diamètre minimal de 457 μm, soit 5-10 fois le diamètre des organoïdes qui sont ensemencés. Pour le transfert de volumes de 2 mL ou plus (par exemple, les étapes 1,16 et 2,1), utiliser des Pipettes sérologiques dont le diamètre de pointe est supérieur à 1 500 μm.
  3. Calculez la densité organoïde à l’aide de l’équation suivante:
    Equation
    La densité souhaitée est de 1 000 organoïdes/mL pour simplifier la dilution. Si la densité est trop faible, centrifuger à 450 x g pendant 5 min et aspirer les médias. Ajouter le support nécessaire pour atteindre 1 000 organoïdes/mL, et Pipetter à fond pour créer un mélange homogène.
    1. Pour cultiver des organoïdes dans une matrice protéique, les organoïdes de semence à une concentration de 1 organoïde/L dans le collagène de type 1 dilué à 87% ou dans la membrane de sous-sol extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm. Tout en travaillant avec des échantillons, garder sur la glace.
    2. Pour geler les organoïdes, transférer le volume désiré à un tube de centrifugation distinct. Tourner vers le bas à 450 x g pendant 5 min. aspirer les médias, puis ajouter le même volume de 90% FBS/10% de DMSO. Résuspendez les organoïdes, puis aliquote dans les CryoTubes. Transférer à-80 ° c, puis à l’azote liquide dans une semaine.
    3. Pour décongeler, réchauffer dans un bain d’eau 37 ° c pendant une minute. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min, puis aspirer les fluides de congélation. Rincer avec le DPBS stérile, puis centrifuger à nouveau. Aspirate DPBS et ajouter des médias organoïdes.
  4. Pipetter 50 μL (50 organoïdes) dans chaque puits de la plaque à faible adhérence (figure 1I).
  5. Ajouter 150 μL de milieux organoïdes pour ramener le volume de travail total à 200 μL. les milieux organoïdes se composent de 1% de pénicilline-streptomycine et de 1% d’insuline-transferrine-sélénium (ITS) dans les milieux DMEM/F12.
  6. Tous les 2 jours, remplacez les médias avec précaution.
    Remarque: les plaques à faible adhérence ne sont pas traitées à la culture tissulaire; par conséquent, les cellules peuvent être facilement détachées. Aspirer les médias lentement en inclinant la plaque et en insérant l’embout de la pipette au bord de chaque puits. Laissez une petite quantité de médias dans le fond du puits. Ajouter un nouveau support lentement pour éviter d’appliquer des forces de cisaillement inutiles aux organoïdes.

3. co-culturing avec les macrophages

  1. Maintenir les macrophages bruts 264,7 marqués GFP ou dTomato dans les milieux DMEM additionnés de 10% de FBS et de 1% de pénicilline-streptomycine. Graine 1 x 104,5 x 104ou 1 x 105 cellules/ml dans un support organoïde.
  2. Utilisez le contraste de phase des cellules vivantes et l’imagerie fluorescente pour surveiller l’infiltration des macrophages au fil du temps.

4. coloration immunofluorescence des organoïdes

Remarque: les organoïdes peuvent être colorés dans des puits à faible adhérence ou peuvent être transférés sur des lames de chambre. Pour transférer, Pipetter doucement vers le haut et vers le bas jusqu’à ce que les organoïdes se détachent des plaques. Transférer aux lames de chambre et incuber pendant 4-8 h pour permettre aux organoïdes d’adhérer à la surface de la plaque.

  1. Retirer le milieu organoïde des puits en aspirant soigneusement. Fixer les échantillons avec 10% de formol tamponné neutre pendant 15 min à RT.
  2. Laver 3x 5 min en 1x PBS. Si désiré, des échantillons fixes peuvent être stockés à 4 ° c pendant une semaine pour une coloration ultérieure.
  3. Perméabilize avec 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène glycol pendant 5 min.
    NOTE: pour colorer l’actine F, incuber des échantillons avec de la phalloïdine diluée 1:1000 et 1,67 nM de colorant nucléaire de bisbenzimide dans 1% de PBS/BSA pendant 1 h à RT. Ensuite, passez à l’étape 4,8.
  4. Bermeabilize avec 0.5 PBS. Les échantillons peuvent être stockés sur des images 4opy et des images immunofluorescentes. les mécanismes qui contribuent à la rlock CTC avec 5% de sérum de chèvre normal dans 0,1% de PBS/polyéthylène glycol monolaurate de sorbitan (PBST) pendant 1 h à RT. laver 3x 5 min avec PBS.
  5. Incuber avec de l’anti-cytokératine 14 dilué 1:1000, E-cadherin dilué 1:200, ou protéine de jonction serrée One dilué 1:100 dans 1% NGS en PBST pendant 1 h à RT. laver 3x 5 min en PBST.
  6. Incuber avec goat anti-rabbit secondaire dilué 1:200 avec 1% NGS/PBST pendant 1 h à RT. recouvrir d’une feuille d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.
  7. Laver 3x 5 min en PBS. Utiliser le colorant nucléaire (voir tableau des matériaux) pour colorer les noyaux.
  8. Laver 3x 5 min en PBS. Si vous utilisez une glissière de chambre, montez avec une lèvre. Conserver enveloppé dans une feuille d’aluminium à 4 ° c pendant 2 semaines.

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Representative Results

Les organoïdes épithéliaux mammaires irradiés ont été obtenus avec succès à partir de glandes mammaires de souris, traitées et cultivées sur des plaques à faible adhérence (figure 1). Le rendement organoïde a été testé par ensemencement dans différents environnements de croissance (figure 2a-G). Les cellules ensemencées directement sur la culture tissulaire traitée sur des plaques cellulaires de 10 cm ont donné une prolifération de cellules fibroblastes. Les fibroblastes ont été identifiés en microscopie à contraste de phase dans ou près du même plan de focalisation que les organoïdes, et ils ont rapidement grandi à partir d’organoïdes plaqués dans quelques jours. Une excroissance de fibroblastes a également été observée lorsque des organoïdes ont été ensemencés dans des matrices de protéine de sous-sol et de collagène (Figure 2e, F).

Une variété de conditions ont été testées pour optimiser la croissance organoïde irradiée (figure 2H). Les collagénases des types I et VIII de Clostridium histolyticum ont été utilisées comme enzyme dans la digestion organoïde étape12,16,17. Les rendements organoïdes étaient significativement plus élevés après digestion avec la collagénase VIII. Cela peut être dû aux procédés de purification utilisés dans la production de l’enzyme: la collagénase de type I est partiellement purifiée et peut causer des dommages inutiles aux protéines et aux récepteurs membranaires, conduisant à une formation organoïde médiocre, à une lyse cellulaire ou à une digestion excessive16 , le 17 , 18. aucune différence significative de rendement entre les organoïdes irradiés et témoins n’a été observée.

Les organoïdes irradiés pourraient être cultivés dans des plaques à faible adhérence (figure 3A-C) ou dans la membrane du sous-sol (figure 3D-G), mais la croissance la plus rapide s’est produite dans les plaques à faible adhérence (figure 3H). Les organoïdes ont récapitulé les caractéristiques de la glande mammaire. Les pointes de flèches blanches indiquent des constructions morphologiquement semblables aux conduits et aux lobes19, 20,21 (figure 3C), qui sont critiques pour la production et le transport du lait dans la glande mammaire21. Cependant, une caractérisation supplémentaire est nécessaire pour confirmer cette observation. Les tendances de croissance indiquent que les organoïdes non irradiés ont augmenté plus rapidement que les organoïdes irradiés (figure 3H), probablement en raison de l’arrêt de la croissance cellulaire résultant des mécanismes de réparation des dommages causés par l’ADN; Cependant, la tendance n’était pas statistiquement significative22. Une agglutination occasionnelle d’organoïdes à faible adhérence a été observée et des organoïdes peuvent être cultivés jusqu’à deux semaines avant de se dissocier.

Les organoïdes expriment les caractéristiques épithéliales, qui ont été évaluées par coloration immunofluorescence de la cytokératine 14 (K14), e-cadhérine (e-CAD), et de la protéine de jonction serrée 1 (zo-1)23,24,25 ( Figure 4). Les organoïdes irradiés expriment des marqueurs épithéliaux. K14, un marqueur du myoépithélium23, a été fortement exprimé à la surface des organoïdes irradiés (figure 4a). En outre, E-CAD et ZO-1 ont été exprimés dans les jonctions cellulaires des organoïdes (figure 4b, C). Ces protéines sont essentielles pour une bonne adhérence des cellules24. Après irradiation, les organoïdes ont continué à conserver leurs caractéristiques épithéliales.

La coloration fluorescente des organoïdes pourrait être visualisée dans des plaques à faible adhérence à l’aide de la microscopie à fluorescence (figure 5A-D); Cependant, la visualisation la plus claire a été obtenue par microscopie confocale (figure 5E-F). L’intensité totale de fluorescence corrigée a été calculée en soustrayant l’arrière-plan et en normalisant par zone organoïde (figure 5G). Les organoïdes de plus en plus élevés dans les plaques à faible adhérence 96-Well ont également simplifié les expériences de co-culture. Lorsqu’elles sont ensemencées à des concentrations typiques dans la glande mammaire, les macrophages sont co-localisés avec le contrôle et les organoïdes irradiés (figure 6)24,26.

Figure 1
La figure 1. Workflow de méthode. A) les glandes mammaires ont été retouchées par des souris. Les glandes mammaires abdominale et inguinales ont été utilisées. Bles glandes mammaires ont été irradiées dans des tubes à centrifugation de 50 ml contenant des milieux DMEM/F12. Cles glandes mammaires ont été transférées dans des plaques stériles à six puits et coupées avec des scalpels chirurgicaux jusqu’à ce qu’elles soient hachéesd. Eles glandes mammaires ont été transférées dans des tubes à centrifugation de 50 ml contenant 5 ml de milieux stériles DMEM/F12 par glande et digéré dans une solution de collagénase VIIIf. (G) après avoir été transféré dans un tube de 15 ml, la différenciation centrifuge a été utilisée pour éliminer les cellules stromales, les cellules individuelles et les globules rouges, observées dans une granule rouge (tête de flèche blanche) jusqu’à ce que seuls les organoïdes épithéliaux blancs aient été obtenus (H ). (I). 50 les organoïdes ont été plaqués dans 200 μl de milieux dans des plaques d’adhérence de 96 puits et ont été imagés en microscopie à contraste de phase la barre d’échelle représente 50 μM. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
La figure 2. Placage organoïde dans les matrices de protéine 3D et sur la culture tissulaire traitée en plastique. Organoïdes ensemencés en collagène (A) et membrane sous-sol (B), imagé après 84 heures de croissance. L’excroissance des fibroblastes s’est produite dans des organoïdes à matrice plaquée (C, D). Des images de contraste de phase des organoïdes triés par filtration ont été obtenues 192 heures après l’ensemencement. Aucune différence majeure n’a été observée entre le filtrat (E) et le rétentat (F), les deux ayant entraîné une croissance des fibroblastes confluentes. Les cellules en E et F ont été ensemencées sur du plastique traité de culture tissulaire. Après la trypsinisation pendant 5 min à RT, les fibroblastes ont été enlevés par aspiration; Cependant, les cellules épithéliales restantes forment une culture monocouche au lieu d’organoïdes tridimensionnels (G). Les barres d’échelle pour A-G représentent 100 μM. (H) les différents types de COLLAGÉNASES (I (ci) et VIII (CVIII)) et les méthodes de traitement des cellules (filtration et différenciation centrifuge (cent diff)) ont été testés et le rendement organoïde par glande mammaire a été quantifiées (n = 2 glandes pour CI, Filter; 2 glandes pour CVIII, Filter; 4 glandes pour CI, cent diff et 12 glandes pour CVIII, cent diff). L’importance statistique a été déterminée à l’aide d’un test t non apparié à deux queues, * * * p < 0,0001. Les barres d’erreur représentent une erreur standard. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
La figure 3. Croissance organoïde représentative. Les images de contraste de phase de la croissance organoïde irradiée dans les plaques à faible adhérence ont obtenu 20 (A), 44 (B) et 106 (C) heures après l’ensemencement. Les pointes de flèches blanches indiquent des structures qui ont une morphologie similaire aux conduits et aux lobes. Les images de contraste de phase de la croissance organoïde irradiée dans la membrane du sous-sol ont obtenu 42 (D), 66 (E), 60 (F) et 114 (G) heures après ensemencement. Les barres d’échelle représentent 50 μM. H. Les mesures de surface ont été obtenues dans différentes conditions de croissance: les organoïdes immédiatement ensemencés après la digestion et le tri (irradié (●), contrôle (▪)) et les organoïdes ensemencés dans la membrane du socle (irradié (○), contrôle (□)) (n = 3 glandes). Les calculs de surface ont été effectués à l’aide du logiciel ImageJ. Les barres d’erreur représentent une erreur standard. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
La figure 4. Expression de marqueur épithélial sur les organoïdes irradiés. La cytokératine 14 (K14, vert), marqueur de la couche basale de l’épithélium squameux et non squameux, a été exprimée sur des organoïdes irradiés (a). L’e-cadhérine (E-CAD), une protéine essentielle à l’adhérence, a été exprimée dans les jonctions entre les cellules des organoïdes irradiés (B). Une protéine de jonction serrée (ZO-1) a également été exprimée dans les jonctions cellulaires des organoïdes irradiés (C). Des images ont été obtenues dans des lames de chambre par microscopie confocale. Une tache d’acide nucléique a été utilisée pour visualiser les noyaux (bleu). Tous les organoïdes ont été fixés et imagés après une semaine de croissance. Les barres d’échelle sont 50 μM. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
La figure 5. Expression de l’actine F dans les organoïdes. L’actine F (rouge), un microfilaments dans les cellules épithéliales, a été exprimée avec une intensité plus faible dans les organoïdes non irradiés (a, C, E) que dans les organoïdes irradiés (B, D, F). Une tache d’acide nucléique a été utilisée pour visualiser les noyaux (bleu). Des images ont été prises sur des plaques à faible adhérence 96-puits (A, B) et des lames de chambre à 16 puits (C, D). Des images ont également été prises en microscopie confocale (E, F). Tous les organoïdes ont été fixés et imagés après une semaine de croissance. Les barres d’échelle sont 50 μM. G. Les données de fluorescence de phalloidine provenant des images de plaques à faible adhérence ont été quantifiées dans ImageJ (n = 3 glandes). Les barres d’erreur indiquent une erreur standard. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
La figure 6. Évaluation des interactions cellule-cellule par la co-culture macrophage-organoïde. Macrophages (rouge) infiltré de contrôle (A) et irradiés (B) organoïdes. Les barres d’échelle représentent 50 μM. La zone moyenne de pourcentage de macrophages dans le champ d’image (C) a été signalée à 24 heures de co-culture pour les organoïdes témoins (jaunes) et irradiés (orange) (n = 3 glandes pour chaque échantillon). Les macrophages ont été ensemencés à des concentrations de 10 000 cellules/ml, 50 000 cellules/mL et 100 000 cellules/ml, et leur infiltration a été capturée toutes les 30 minutes par imagerie par fluorescence de cellules vivantes. Toutes les expériences de co-culture ont débuté 7 jours après l’ensemencement organoïde initial. L’importance statistique a été déterminée à l’aide d’un test t non apparié à deux queues, * p < 0,05, * * * p < 0,0001. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons développé une méthode pour la croissance reproductible et la caractérisation des organoïdes des mammaires irradiés (figure 1). Une dose d’irradiation de 20 GY a été appliquée pour refléter les précédents modèles in vivo de recrutement de cellules tumorales5. L’irradiation des glandes mammaires ex vivo avant la formation organoïde a permis l’isolement des effets de dommages de rayonnement sans infiltration correspondante des cellules immunitaires. La mise au point d’un modèle de tissu normal irradié in vitro permet de visualiser en temps réel les interactions cellulaires qui peuvent contribuer au recrutement de CTC induite par le rayonnement11,12.

Suivre de près les étapes 1.5 à 1.18 était essentiel pour maximiser le rendement organoïde. Nous avons ajouté des aliquotes décongelés de collagénase concentrée à la solution digestive. En raison de la nature très visqueuse de la collagénase concentrée aliquote, il peut y avoir quelques variations de quantité et donc dans l’activité enzymatique, de sorte que la digestion organoïde doit être étroitement surveillée pour éviter la surdigestion. Il est également important de digérer les organoïdes dans un tube de 50 mL car cela permet une surface uniforme pour la digestion. D’autres études ont utilisé la filtration pour purifier les organoïdes19,23; Cependant, nous avons obtenu un rendement beaucoup plus élevé purifiant avec la différenciation centrifuge (figure 2H). Les pipettes de pré-enrobage, les pointes de pipette et les tubes à centrifuger avec la solution BSA sont indispensables pour maximiser le rendement. Les organoïdes adhèrent sensiblement au plastique non couché lorsque l’application de la solution est négligée.

Un grand soin doit être pris pour éviter d’aspirer les organoïdes. Il s’agit d’un risque qui se produit lors de la purification, la modification des médias, et la coloration pour les marqueurs fluorescents. L’utilisation de plaques à faible adhérence pour la croissance permet un transfert facile des organoïdes et élimine le besoin d’organoïdes d’être sectionné en PTOM pour plus de coloration, une procédure requise pour les organoïdes embarqués de membrane de sous-sol11. En plus des avantages d’une croissance supérieure, l’ensemencement d’organoïdes irradiés dans des plaques à faible adhérence nécessitait moins d’étapes et était moins techniquement difficile que la culture des organoïdes dans la membrane du sous-sol ou le collagène. Cependant, lors de la coloration des marqueurs, il peut être utile de voir des organoïdes sous un microscope pour s’assurer que l’aspiration accidentelle ne se produit pas.

En outre, il y a beaucoup de considérations qui doivent être prises en compte lors de l’imagerie des organoïdes. Dans les organoïdes intégrés à membrane sous-sol, une croissance occasionnelle des fibroblastes peut être observée (Figure 2c, D). L’excroissance des fibroblastes dans les organoïdes de culture 3D peut être causée par des organoïdes qui font le contact avec la surface traitée de culture tissulaire comme l’adhérence conduit à la production de facteur de croissance de fibroblastes augmentée dans les cellules adhérentes27. Fait intéressant, la morphologie de ces fibroblastes est étonnamment similaire aux pré-adipocytes car les deux types de cellules présentent des formes allongées, de forme allongée28. Dans une étude plus approfondie, l’exposition à l’insuline, à la dexaméthasone et à la 3-isobutyle-1-méthylxanthine (IBMX) peut donner des cellules ayant une lignée adipogénique, ce qui stimule un déplacement vers une forme cellulaire plus sphérique associée aux adipocytes28, 29. nous avons obtenu des images claires à l’aide de la microscopie à contraste de phase de la faible adhérence (figure 3A-C) et de la membrane sous-sol incorporée (figure 3D-G) organoïdes. Le suivi de la croissance organoïde individuelle dans les plaques à faible adhérence, cependant, a été difficile en raison d’adhérences focales minimales entre les cellules et la surface du puits, entraînant un mouvement organoïde et une aspiration occasionnelle.

Une fois colorées pour les marqueurs de surface, la microscopie confocale a rendu la localisation des marqueurs plus claire (figure 5e, F) que la microscopie à large champ (figure 5A-D). À partir de la quantification par fluorescence, les tendances de l’expression de la phalloïdine suggèrent que les organoïdes irradiés expriment une augmentation de l’actine F par rapport au contrôle (figure 5G). La réorganisation du cytosquelette d’actine a été observée dans les cellules endothéliales microvasculaires cutanées irradiées à des doses similaires30.

Pour les séquences d’imagerie étendues, comme la co-culture temporelle avec les cellules immunitaires (figure 6), une chambre d’imagerie à cellules vivantes avec humidité et contrôle co2 est requise31. Les images de cellules vivantes prises toutes les 30 minutes révèlent que les macrophages co-localisés avec des organoïdes après 24 heures (figure 6A, B), migrent préférentiellement vers des organoïdes irradiés (figure 6C). L’infiltration de macrophages dans le tissu normal irradié a été observée in vivo, est attribuée à des gradients de Chemokine et de cytokine, et précède généralement le recrutement de CTC5. Les études futures évalueront les interactions de macrophages classiques et alternativement activées avec des organoïdes, car la dynamique des macrophages polarisés peut jouer un rôle important dans la détermination de la réponse aux rayonnements32,33. Des analyses additionnelles évalueront les conséquences de la famine sérique et des effets de croissance de la culture des organoïdes dans les milieux complets, car ces variables peuvent avoir des effets significatifs sur les interactions entre les cellules immunologiques organoïdes. Ce système peut encore être adapté à la co-culture avec d’autres types de cellules, y compris les cellules T + +, les cellules stromales, les adipocytes et les cellules cancéreuses du sein. L’observation en temps réel avec des techniques comme l’imagerie cellulaire en direct facilitera l’élucidation des mécanismes potentiels qui contribuent au recrutement de la CCT aux tissus normaux irradiés, ce qui peut avoir des implications significatives pour les patients souffrant de récurrence TNBC.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Laura L. BRONSART d’avoir fourni des macrophages bruts 264,7 de GFP et de dTomato. Cette recherche a été financée financièrement par la subvention NIH #R00CA201304.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128
Anti-cytokeratin 14 abcam ab181595 Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin Sigma A1933-25G
Collagen Type I Corning 354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII Sigma C2139
Collagenase I Gibco 17018029
DMEM/F12 Thermofisher 11320-033
DNAse Roche 10104159001
DPBS Fisher 14190250
E-Cadherin Cell Signaling 24E10 Lot: 13
FBS Sigma F0926
Gentamicin Gibco 15750
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150077 green
Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150080 red
Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342 Fisher 62249 Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL) Sigma I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x Gibco 51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) Corning 356237
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates Thermo 174927
PBS VWR 10128-856
Pen/strep Fisher 15140122
Phalloidin abcam ab176757 Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1 Novus NBP1-85047 Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) Sigma X100-100ML
Trypsin Gibco 27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) Sigma P1379-100ML

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References

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Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires
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Chapter 7: Interactions Between Cells and Their Environment

Extracellular Interactions
Engineering Linkage: Organoids
Interactions of Cells with Extracellular Materials
Interactions of Cells with Other Cells
Tight Junctions: Sealing the Extracellular Space
Intercellular Communication
Cell Walls
Green Cells: Cell Walls and Plant Terrestrialization

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