Summary
Organóides desenvolvidos a partir de glândulas mamárias do camundongo foram irradiados e caracterizados para avaliar características epiteliais e interações com células imunes. Os organóides irradiados podem ser usados para melhor avaliar as interações célula-célula que podem levar ao recrutamento de células tumorais em tecido normal irradiado.
Abstract
Os organóides derivados do tecido digerido são construções tridimensionais multicelulares (3D) que melhor recapitulam as condições in vivo do que as monolayers celulares. Embora não possam modelar completamente a complexidade in vivo, mantêm alguma funcionalidade do órgão original. Em modelos de câncer, os organóides são comumente usados para estudar a invasão de células tumorais. Este protocolo tem como objetivo desenvolver e caracterizar organóides do tecido mamário do camundongo normal e irradiado para avaliar a resposta à radiação em tecidos normais. Estes organoids podem ser aplicados aos estudos in vitro futuros do cancro para avaliar interações da pilha do tumor com organoids irradiados. As glândulas mamárias resected, irradiadas a 20 GY e digeridas em uma solução do colagenase VIII. Os organoids epithelial foram separados através da diferenciação centrífuga, e os organoids 3D foram desenvolvidos em microplates da baixo-adesão do 96-well. Os organoids expressaram o marcador epithelial característico Cytokeratin 14. A interação dos macrófagos com os organóides foi observada em experimentos de cocultura. Este modelo pode ser útil para o estudo de interações tumor-estromal, infiltração de células imunes e polarização de macrófagos dentro de um microambiente irradiado.
Introduction
Aproximadamente 60% dos pacientes com câncer de mama triplo negativo (TNBC) escolhem a terapia conservadora da mama (BCT) como forma de tratamento1. Nesta modalidade do tratamento, o tumor que contem a parte do tecido do peito é removido, e o tecido normal circunvizinho é exposto à radiação ionizante para matar todas as pilhas residuais do tumor. O tratamento reduz a recorrência em grande parte da população de câncer de mama; Entretanto, aproximadamente 13,5% dos pacientes tratados com TNBC experimentam recidivas locoregionais2. Portanto, estudar como a radiação pode recrutar células tumorais circulantes (CTCs) levará a importantes insights sobre a recorrência local3,4.
O trabalho precedente mostrou que a radiação do tecido normal aumenta o recrutamento de vários tipos da pilha5. Em modelos pré-clínicos de TNBC, a irradiação do tecido normal aumentou o macrófago e subseqüentemente o recrutamento da pilha do tumor aos tecidos normais5. O estado imunológico influenciou o recrutamento de células tumorais a sítios irradiados, com migração de células tumorais observada em indivíduos imunocomprometidos. Recapitulando essas interações usando organóides derivados de glândulas mamárias permitirá a observação da migração celular e interações célula-stromal em tempo real com microscopia e imagens de células vivas para determinar o papel de dano de radiação na alteração comportamento de células tumorais.
Os organóides mamários do camundongo ajudaram a elucidar passos importantes no desenvolvimento da glândula mamária. Um organóide mamário é um construto tridimensional multicelular de epitélio mamário isolado que é maior que 50 μm6,7,8,9,10. Usando organóides epiteliais primários, Simian et al. avaliaram os fatores necessários para a ramificação na glândula mamária7. Shamir et al. descobriram que a disseminação pode ocorrer sem uma transição epitelial para mesenquimal, proporcionando uma visão da cascata metastática8. Os métodos para a geração e caracterização de organóides do tecido da glândula mamária estão bemestabelecidos6,11,12,13. Entretanto, a nosso conhecimento, os métodos para crescer organoids irradiados das glândulas mamária não foram relatados. Um protocolo para o cultivo e a caracterização de organóides irradiados seria um passo crítico na recapitulação do recrutamento de células imunes e tumorais induzidas por radiação.
Neste trabalho, nós relatamos um método para crescer e caracterizar os organoids epithelial mamária irradiados em microplates baixos da adesão revestidos com um polímero hidrófilo que apoie a formação de spheroids. Esses organóides foram cocultivados com macrófagos para examinar a cinética de infiltração de células imunológicas. Este trabalho pode ser estendido para incluir os organoids coculturing com pilhas adiposas para recapitular características mamária, pilhas do cancro da mama para visualizar o recrutamento da pilha do tumor, e CD8 + pilhas de T para estudar interações tumor-imunes da pilha. Protocolos previamente estabelecidos podem ser utilizados para avaliar organóides irradiados. Os modelos mais adiantados que cocultivam organoids mamária e pilhas imunes derramaram a luz em mecanismos da metástase e da disseminação. DeNardo et al. verificaram que a regulação da célula T CD4 + de macrófagos associados ao tumor aumentou um fenótipo metastático de adenocarcinomas mamários14. Modelos de cocultura também têm sido utilizados para elucidar mecanismos de desenvolvimento biológico. Plaks et al. esclareceram o papel das células T CD4 + como reguladores da organogênese mamária15. Entretanto, nosso grupo é o primeiro a estabelecer um procedimento de Visualizar como a irradiação normal do tecido influencia o comportamento da pilha imune. Porque a irradiação normal do tecido foi mostrada para realçar o recrutamento da pilha do tumor5, este protocolo pode mais ser desenvolvido para analisar como o comportamento da pilha do tumor é alterado pela irradiação do tecido e das pilhas normais, conduzindo a uma compreensão maior de recorrência do cancro.
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Protocol
Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos institucionais aprovados pela Comissão de cuidados e uso de animais institucionais da Universidade Vanderbilt.
1. preparação de camundongos e aquisição de células (adaptado de Nguyen-Ngoc et al.11)
- Sacrifique ratos de nu/nu atímicos (8-10 semanas velho) usando a asfixia de co2 seguida pela deslocação cervical. Limpe a pele com 70% de etanol.
- Resect glândulas mamárias abdominais e inguinais de camundongos usando tesouras pré-esterilizadas e fórceps. Remover linfonodos antes da ressecção. Enxaguar em soro fisiológico com tampão 1x estéril (PBS) (Figura 1a).
- Coloque-o em tubos de 15 mL com 10 mL de Dulbecco ' s Modified Eagle Media/nutriente mistura F12 (DMEM/F12) para transporte. As amostras podem ser mantidas durante a noite a 4 ° c ou processadas imediatamente. Mantenha no gelo.
- Irradiam amostras a 20 GY utilizando uma fonte de césio (Figura 1b).
- 45 min após a irradiação, coloque as glândulas mamárias em uma placa celular estéril de 35 mm e mince com bisturis (Figura 1C, D). Mince com aproximadamente 40 cursos até que o tecido relaxa e as partes são obtidas que não são maiores do que aproximadamente 1 milímetro2 na área.
- Transferir para a solução de colagenase num tubo centrífugo de 50 mL. A solução de colagenase consiste em 2 mg/ml de colagenase (ver tabela de materiais), 2 mg/ml de tripsina, 5% v/v de soro bovino fetal (FBS), 5 μg/ml de insulina e 50 μg/ml de gentamicina em meios DMEM/F12. Use solução de colagenase de 10 ml por rato.
- Coloc em um banho de água em 37 ° c, vortexing cada 10 minutos para 30-60 min. a digestão está completa quando a solução de colagenase está turva (Figura 1e, F).
- Gire para baixo a solução digerida em 450 x g por 10 minutos à temperatura ambiente (RT). Três camadas serão observadas. O sobrenadante é composto de gordura, a camada média é uma solução aquosa, e o fundo é um pellet. O pellet aparecerá vermelho, pois é uma mistura de células epiteliais, células estromais individuais e glóbulos vermelhos (Figura 1G).
- Precoat todas as pipetas, pontas da pipeta, e tubos de centrifugação com a solução da albumina de soro bovina (BSA) antes do contato. A solução de BSA consiste em 2,5 w/v% BSA no fosfato tamponado salina de Dulbecco (DPBS). Para o pre-revestimento, adicione simplesmente então remova a solução de BSA ao interior da ponta e dos tubos da pipeta. A solução de BSA pode ser reutilizada, embora deva ser filtrada estéril antes de cada experimento.
- Para recuperação adicional, transfira o sobrenadante para um tubo de 15 mL revestido de BSA fresco. Pipeta para cima e para baixo vigorosamente para dispersar a camada de gordura. Centrifugue a 450 x g durante 10 min a RT. Aspire o sobrenadante, deixando uma pequena quantidade de meios de comunicação no tubo para evitar aspirar o pellet celular.
- Aspirar a camada aquosa do tubo com o pellet original.
- Adicione 10 mL de DMEM/F12 ao tubo com o pellet original e transfira para o segundo tubo. Pipetar vigorosamente para combinar e suspender as duas Pelotas.
- Centrifugue a 450 x g durante 10 min a RT. aspirar o sobrenadante e adicionar 4 ml de DMEM/F12 ao tubo.
- Adicionar 40 μL de desoxirribonuclease (DNase) à suspensão e agitar suavemente à mão durante 2-5 min na solução RT. DNase consiste em 4 U/mL DNase em DMEM/F12.
- Adicione 6 mL de DMEM/F12 e pipeta completamente. Centrifugue o tubo a 450 x g durante 10 min em RT.
- Aspirar sobrenadante à marca de 0,5 mL. Resuspend em 10 mL de DMEM/F12 e pipeta completamente.
- Pulse para 450 x g e Stop 4 s depois de atingir essa velocidade.
- Repita as etapas 1.16-1.17 mais três vezes para purificar organóides através de diferenciação centrífuga. A pelota deve agora ser uma cor off-White consistindo apenas de organóides epiteliais (Figura 1h).
Nota: os organóides também podem ser filtrados usando filtros estéreis de malha 40 μm. Após a etapa 1,16, os meios de pipetas contendo organóides através de um filtro em um tubo de centrífuga e, em seguida, enxaguar com 5 a 10 mL de mídia DMEM/F12. Vire o filtro sobre um novo tubo centrífugo 50 mL. Passe 10 mL de mídia DMEM/F12 através de, indo o caminho oposto para enxaguar qualquer retentado. O retentado deve consistir nos organoids, e o filtrado deve consistir principalmente das pilhas stromal, que podem ser descartadas ou mantidas se desejadas.
2. determinando a densidade e o chapeamento organoids
- Resuspend pellet em 10 mL de DMEM/F12. Pipeta completamente para criar uma solução homogênea.
- Transfira 50 μL para um prato de Petri de 30 mm e vista um microscópio de contraste de fase a 20x. Conte o número de organóides com um contador de contagem.
Nota: aqui as pontas da pipeta foram usadas consistentemente com um diâmetro mínimo de 457 μm, que é 5-10 vezes o diâmetro dos organoids que são semeados. Para a transferência de volumes de 2 mL ou maiores (por exemplo, etapas 1,16 e 2,1), use Pipetas sorológicas com diâmetros de ponta superiores a 1.500 μm. - Calcule a densidade organóide usando a seguinte equação:
A densidade desejada é 1.000 organóides/mL para simplificar a diluição. Se a densidade for muito baixa, centrifugue a 450 x g por 5 min e aspirar a mídia. Adicionar meios necessários para alcançar 1.000 organoids/mL, e pipeta completamente para criar uma mistura homogênea.- Para cultivar organóides em uma matriz proteica, organóides de sementes em uma concentração de 1 organóide/L em colágeno tipo 1 diluído a 87% ou na membrana basal extraída do sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm mouse. Ao trabalhar com amostras, mantenha no gelo.
- Para congelar organóides, transfira o volume desejado para um tubo de centrífuga separado. Girar para baixo em 450 x g por 5 min. aspirar mídia e, em seguida, adicione o mesmo volume de 90% FBS/10% DMSO. Resuspend os organoids, e então alíquota em cryotubes. Transferência para-80 ° c, e depois para nitrogênio líquido dentro de uma semana.
- Para descongelar, aqueça em um banho de água de 37 ° c para um minuto. Centrifugue em 450 x g por 5 minutos, e então aspirar meios congelantes. Enxague com DPBS estéril e, em seguida, centrifugue novamente. Aspirar DPBS e adicionar meios organóides.
- Pipetas 50 μL (50 organóides) em cada poço da placa de baixa aderência (Figura 1I).
- Adicionar 150 μL de meios organóides para trazer o volume de trabalho total para 200 μL. a mídia Organóide consiste de 1% de penicilina-estreptomicina e 1% de insulina-transferrina-selênio (ITS) em DMEM/F12 Media.
- A cada 2 dias substitua a mídia com cuidado.
Nota: as baixas placas da adesão não são cultura do tecido tratada; Portanto, as células podem ser facilmente separadas. Aspirar a mídia lentamente inclinando a placa e inserindo a ponta da pipeta na borda de cada poço. Deixe uma pequena quantidade de mídia no fundo do poço. Adicionar novas mídias lentamente para evitar a aplicação de forças de cisalhamento desnecessárias para organóides.
3. coculturação com macrófagos
- Manter GFP ou dTomato-rotulados RAW 264,7 macrófagos em DMEM mídia suplementada com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina. Semente 1 x 104, 5 x 104, ou 1 x 105 células/ml em meios organóides.
- Use contraste de fase de células vivas e imagens fluorescentes para monitorar a infiltração de macrófagos ao longo do tempo.
4. coloração de imunofluorescência de organóides
Nota: os organóides podem ser manchados em poços de baixa aderência ou podem ser transferidos para lâminas de câmara. Para transferir, pipetar suavemente para cima e para baixo até que os organóides descolaram das placas. Transferência para lâminas de câmara e incubar para 4-8 h para permitir que organóides aderir à superfície da placa.
- Retire o meio organóide dos poços cuidadosamente aspirando. Fixar amostras com formalina tamponada neutra a 10% por 15 min na RT.
- Lave 3x 5 min em PBS 1x. Se desejado, as amostras fixas podem ser armazenadas em 4 ° c por uma semana para uma coloração mais adicional.
- Permeabilize com 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-Tetrametilbutilo) fenil-polietileno glicol por 5 min.
Nota: para mancha de F-Actina, incubar amostras com faloidina diluído 1:1000 e 1,67 nm de corante nuclear bisbenzimide em PBS 1%/BSA para 1 h em RT. Em seguida, avance para o passo 4,8. - Bermeabilize com 0.5 PBS. As amostras podem ser armazenadas em imagens 4opy e imagens imunofluorescentes. mecanismos que contribuem para rlock CTC com soro de cabra normal de 5% em 0,1% PBS/polietileno glicol monolaurato de sorbitano (PBST) por 1 h em RT. Lave 3x 5 min com PBS.
- Incubar com o anti-Cytokeratin 14 diluído 1:1000, E-cadherin diluiu 1:200, ou a proteína apertada da junção uma diluiu 1:100 em 1% NGS em PBST para 1 h no RT. Lave 3x 5 min em PBST.
- Incubar com cabra anti-Rabbit secundário diluído 1:200 com 1% NGS/PBST para 1 h na RT. Cubra com folha para evitar a exposição à luz.
- Lave 3x 5 min em PBS. Use o corante nuclear (ver tabela de materiais) para manchar os núcleos.
- Lave 3x 5 min em PBS. Se estiver usando a corrediça da câmara, monte com uma lamínula. Armazene envolvido na folha em 4 ° c por até 2 semanas.
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Representative Results
Os organóides mamários epiteliais irradiados foram obtidos com sucesso de glândulas mamárias de camundongo, processadas e cultivadas em placas de baixa adesão (Figura 1). A produção de organóides foi testada por semeadura em diferentes ambientes de crescimento (Figura 2a-G). Semeando pilhas diretamente na cultura do tecido tratou 10 placas de pilha do cm rendeu um overgrowth de pilhas do fibroblasto. Fibroblastos foram identificados em microscopia de contraste de fase em ou perto do mesmo plano de foco como organóides, e eles rapidamente cresceram a partir de organóides chapeados dentro de alguns dias. Um conseqüência dos fibroblasto foi observado igualmente quando os organoids foram semeados em matrizes da membrana do porão e da proteína do colagénio (Figura 2E, F).
Uma variedade de condições foi testada na otimização do crescimento organóide irradiado (Figura 2h). Os tipos de colagenases I e VIII de Clostridium histolyticum foram utilizados como enzima na digestão organóide etapa12,16,17. Os rendimentos organóides foram significativamente maiores após a digestão com colagenase VIII. Isso pode ser devido aos processos de purificação utilizados na produção da enzima: o tipo de colagenase I é parcialmente purificado e pode causar danos desnecessários às proteínas e receptores de membrana, levando a má formação organóide, lise celular ou excesso de digestão16 , 17 anos de , 18. não foram observadas diferenças significativas na produtividade entre os organóides irradiados e controle.
Os organóides irradiados poderiam ser cultivados em placas de baixa aderência (Figura 3a-C) ou dentro da membrana basal (Figura 3D-G), mas o crescimento mais rápido ocorreu em placas de baixa aderência (Figura 3h). Os organóides recapitularam as características da glândula mamária. As pontas de seta brancas indicam construções morfologicamente semelhantes aos ductos e lóbulos19, 20,21 (Figura 3C), que são críticos para a produção e transporte de leite na glândula mamária21. Entretanto, uma caracterização mais adicional é exigida para confirmar esta observação. As tendências de crescimento indicaram que os organóides não irradiados cresceram mais rapidamente do que os organóides irradiados (Figura 3h), provavelmente devido à parada de crescimento celular decorrente de mecanismos de reparo de danos ao DNA; Entretanto, a tendência não foi estatisticamente significante22. A aglomeração ocasional de baixos organoids da adesão foi observada, e os organoids podiam ser cultivados até duas semanas antes de Dissociating.
Os organóides expressaram características epiteliais, que foram avaliadas através de coloração por imunofluorescência de citoqueratina 14 (K14), e-caderina (e-CAD) e proteína de junção apertada 1 (zo-1)23,24,25 ( Figura 4). Os organoids irradiados expressaram marcadores epithelial. K14, um marcador do myoepitélio23, foi expressado fortemente na superfície de organoids irradiados (figura 4a). Adicionalmente, o E-CAD e o ZO-1 foram expressos em junções celulares de organóides (Figura 4B, C). Estas proteínas são essenciais para a adesão celular adequada24. Após a irradiação, os organóides continuaram a reter suas características epiteliais.
Coloração fluorescente de organóides pode ser visualizada dentro de placas de baixa aderência utilizando microscopia de fluorescência (Figura 5a-D); Entretanto, a visualização mais clara foi obtida por microscopia confocal (Figura 5E-F). A intensidade de fluorescência total corrigida foi calculada subtraindo-se o fundo e normalizando-se pela área organóide (Figura 5g). Os organóides crescentes nas placas de baixa adesão de 96 poços também simplificaram experimentos de cocultura. Quando semeadas em concentrações típicas da glândula mamária, os macrófagos colocalizaram-se com controle e organóides irradiados (Figura 6)24,26.
Figura 1. Fluxo de trabalho do método. (A) as glândulas mamárias foram ressecadas de camundongos. As glândulas mamárias abdominais e inguinal foram utilizadas. (B) as glândulas mamárias foram irradiadas em 50 tubos de centrífuga ml contendo mídia DMEM/F12. (C) as glândulas mamárias foram transferidas para placas estéreis de seis poços e cortadas com Bisturis cirúrgicos até picadas (D). (E) as glândulas mamárias foram transferidas para 50 ml de tubos centrífugos contendo 5 ml de meios DMEM/F12 estéreis por glândula e digeridos em solução de colagenase VIII (F). (G) após a transferência para um tubo de 15 ml, foi utilizada a diferenciação centrífuga para remover células estromais, células únicas e glóbulos vermelhos, observadas em um pellet vermelho (cabeça de seta branca) até que apenas os organóides epiteliais brancos fossem obtidos (H ). (I). 50 os organóides foram chapeados em 200 μL de mídia em placas de adesão 96-bem baixas e imaged usando microscopia de contraste de fase a barra de escala representa 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Chapeamento organoid em matrizes da proteína 3D e no plástico tratado cultura do tecido. Organóides semeados em colágeno (A) e membrana basal (B), imaged após 84 horas de crescimento. O crescimento de fibroblastos ocorreu em organóides revestidos por matrizes (C, D). Imagens de contraste de fase de organóides ordenados por filtração foram obtidas 192 horas após a semeadura. Não foram observadas diferenças significativas entre o filtrado (e) e retentado (F), resultando em crescimento de fibroblastos confluentes. As pilhas em e e em F foram semeadas no plástico tratado cultura do tecido. Após trypsinizing por 5 minutos no RT, os fibroblasto foram removidos através da aspiração; Entretanto, as pilhas epithelial restantes deram forma a uma cultura do monocamada em vez dos organoids tridimensional (G). As barras de escala para a-G representam 100 μm. (H) diferentes tipos de colagenases (I (CI) e VIII (cviii)) e métodos de processamento celular (filtração e diferenciação centrífuga (Cent diff)) foram testados, e o rendimento organóide por glândula mamária foi quantificados (n = 2 glândulas para CI, filtro; 2 glândulas para CVIII, filtro; 4 glândulas para CI, Cent diff, e 12 glândulas para CVIII, Cent diff). A significância estatística foi determinada por meio de teste t bicaudal, não pareado, * * * p < 0,0001. Barras de erro representam erro padrão. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Crescimento Organóide representativo. Imagens de contraste de fase do crescimento organoide irradiado em placas de baixa aderência obtiveram 20 (A), 44 (B) e 106 (C) horas após a semeadura. As pontas de seta brancas indicam as estruturas que têm a morfologia similar aos dutos e aos lóbulos. As imagens do contraste da fase do crescimento organoid irradiado na membrana do porão obtiveram 42 (D), 66 (e), 60 (F), e 114 (G) horas após a semeadura. As barras de escala representam 50 μm. H. As medidas de área foram obtidas em diferentes condições de crescimento: organóides imediatamente semeados após a digestão e triagem (irradiada (●), controle (▪)) e organóides semeados na membrana basal (irradiado (○), controle (□)) (n = 3 glândulas de cada). Os cálculos de área foram feitos usando o software ImageJ. Barras de erro representam erro padrão. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Expressão do marcador epitelial em organóides irradiados. A citoqueratina 14 (K14, verde), um marcador para a camada basal de epíteto escamoso e não escamoso, foi expressa em organóides irradiados (a). A e-caderina (E-CAD), uma proteína essencial para a adesão, foi expressa dentro das junções entre células em organóides irradiados (B). Uma proteína de junção apertada (ZO-1) também foi expressa nas junções celulares de organóides irradiados (C). As imagens foram obtidas em lâminas de câmara por microscopia confocal. Uma mancha de ácido nucleico foi usada para visualizar núcleos (azul). Todos os organóides foram fixados e imaged após uma semana de crescimento. As barras de escala são 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Expressão de F-Actina em organóides. A F-Actina (vermelha), um Microfilamento em células epiteliais, foi expressa com menor intensidade em organóides não irradiados (a, C, E) do que em organóides irradiados (B, D, F). Uma mancha de ácido nucleico foi usada para visualizar núcleos (azul). As imagens foram tiradas em placas de baixa aderência 96-poços (A, B) e 16 poços de câmara (C, D). As imagens também foram realizadas utilizando microscopia confocal (e, F). Todos os organóides foram fixados e imaged após uma semana de crescimento. As barras de escala são 50 μm. G. Dados de fluorescência de Phalloidin de imagens de baixa placa de adesão foram quantificados em ImageJ (n = 3 glândulas). Barras de erro indicam erro padrão. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Avaliando interações célula-célula através da cocultura macrófago-organóide. Macrófagos (vermelho) infiltrados controle (A) e irradiados (B) organóides. As barras de escala representam 50 μm. A área percentual média de macrófagos no campo da imagem (C) foi relatada em 24 horas de cocultura para controle (amarelo) e organóides (laranja) irradiados (n = 3 glândulas para cada amostra). Os macrófagos foram semeados em concentrações de 10.000 células/ml, 50.000 células/mL e 100.000 células/mL, e sua infiltração foi capturada a cada 30 minutos através de imagens de fluorescência de células vivas. Todas as experiências da cocultura começaram 7 dias após a semeadura organoid inicial. A significância estatística foi determinada por meio de teste t bicaudal, não pareado, * p < 0,05, * * * p < 0,0001. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, desenvolvemos um método de crescimento reprodutível e caracterização de organóides mamários irradiados (Figura 1). Uma dose da irradiação de 20 GY foi aplicada para espelhar modelos in vivo precedentes do recrutamento da pilha do tumor5. A irradiação de glândulas mamárias ex vivo antes da formação organoide permitiu o isolamento de efeitos de dano de radiação sem uma infiltração correspondente de células imunes. O desenvolvimento de um modelo de tecido normal irradiado in vitro possibilita a visualização em tempo real de interações celulares que podem contribuir para o recrutamento de CTC induzido por radiação11,12.
As etapas de seguimento pròxima 1.5-1.18 eram críticas para maximizar o rendimento organoid. Foram adicionadas alíquotas descongeladas de colagenase concentrada à solução digestiva. Devido à natureza altamente viscosa do aliquot concentrado da colagenase, pode haver algumas variações na quantidade e conseqüentemente na atividade enzimática, assim que a digestão do organoid deve rigorosamente ser monitorada para evitar a excesso-digestão. Também é importante para digerir organóides em um tubo de 50 mL, pois isso permite uma área de superfície uniforme para a digestão. Outros estudos utilizaram filtração para purificar organoides19,20; no entanto, obteve-se um rendimento muito maior, purificante com diferenciação centrífuga (Figura 2h). Pipetas de pré-revestimento, ponteiras de pipeta e tubos centrífugos com a solução BSA são essenciais para maximizar o rendimento. Organóides visivelmente aderir ao plástico não revestido quando a aplicação da solução é negligenciada.
Grande cuidado deve ser tomado para evitar os organóides aspirantes. Este é um risco que ocorre quando purifying, mudando a mídia, e manchando para marcadores fluorescentes. Usando placas de baixa aderência para o crescimento permite a fácil transferência de organóides e elimina a necessidade de organóides para ser seccionado em outubro para mais coloração, um procedimento necessário para a membrana basal incorporado organóides11. Além dos benefícios do crescimento superior, a semeadura de organóides irradiados em placas de baixa aderência exigiu menos etapas e foi menos tecnicamente desafiadora do que cultivar organóides na membrana basal ou colágeno. Entretanto, ao manchar para marcadores, pode ser útil ver organoids um microscópio para assegurar-se de que a aspiração acidental não ocorra.
Além disso, há muitas considerações que devem ser esclarecidos quando organoids da imagem latente. Dentro da membrana basal organóides embutidos, pode-se observar um crescimento ocasional de fibroblastos (Figura 2C, D). O conseqüência do fibroblasto em 3D organoids cultivados pode ser causado pelos organoids que fazem o contato com a superfície tratada cultura do tecido porque a adesão conduz à produção upregulated do fator de crescimento do fibroblasto em pilhas aderentes27. Curiosamente, a morfologia desses fibroblastos é notavelmente semelhante aos pré-adipócitos, uma vez que ambos os tipos de células exibem formas alongadas e finas28. Em investigações posteriores, a exposição à insulina, dexametasona e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) pode produzir células com linhagem adipogênica, estimulando uma mudança para uma forma celular mais esférica associada aos adipócitos28, 29. obtivemos imagens claras utilizando microscopia de contraste de fase de baixa adesão de crescimento livre (Figura 3a-C) e membrana basal incorporada (Figura 3D-G) organóides. Controlar o crescimento individual do organoid em placas baixas da adesão, entretanto, era difícil devido às adesões focais mínimas entre as pilhas e a superfície do poço, tendo por resultado o movimento organoid e a aspiração ocasional.
Uma vez manchada para os marcadores de superfície, a microscopia confocal rendeu a localização mais clara do marcador (Figura 5E, F) do que a microscopia do Widefield (Figura 5a-D). Da quantificação da fluorescência, as tendências na expressão de faloidina sugerem que os organoids irradiados expressaram o F-Actin aumentado relativo ao controle (Figura 5g). A reorganização do citoesqueleto de actina foi observada em células endoteliais microvasculares dérmicas irradiadas em dosagens semelhantes30.
Para sequências de imagens estendidas, como a cocultura de lapso de tempo com células imunes (Figura 6), uma câmara de imagem de células vivas com umidade e controle de co2 é necessária31. Imagens de células vivas tiradas a cada 30 minutos revelaram que os macrófagos foram colocalizados com organóides após 24 horas (Figura 6a, B), preferencialmente migrando para organóides irradiados (Figura 6C). A infiltração do macrófago no tecido normal irradiado foi observada in vivo, é atribuída aos Gradients do quimiocina e do citocinas, e precede tipicamente o recrutamento do CTC5. Estudos futuros avaliarão interações de macrófagos classicamente e alternativamente ativadas com organóides, uma vez que a dinâmica de macrófagos polarizados pode desempenhar um papel importante na determinação da resposta à radiação32,33. As análises adicionais avaliarão a conseqüência da inanição do soro e os efeitos do crescimento de organoids de cultivo em meios completos desde que estas variáveis podem ter efeitos significativos em interações organoid-imunes da pilha. Este sistema pode ainda ser adaptado para a cocultura com outros tipos de células, incluindo células T CD8 +, células estromais, adipócitos e células cancerosas da mama. A observação em tempo real com técnicas como a imagem latente da pilha viva facilitará o elucidação de mecanismos potenciais que contribuem ao recrutamento do CTC ao tecido normal irradiado, que pode ter implicações significativas para os pacientes que sofrem do periódico TNBC.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Laura L. Bronsart por fornecer GFP e dTomato-rotulados RAW 264,7 macrófagos. Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pelo subsídio NIH #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
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