Summary
Органоиды, разработанные из молочных желез мышей были облучены и характеризуется для оценки эпителиальных признаков и взаимодействий с иммунными клетками. Облученных органоиды могут быть использованы для более эффективного оценки клеточных взаимодействий клеток, которые могут привести к набору опухолевых клеток в облучении нормальной ткани.
Abstract
Органоиды, получаемые из переваренной ткани, представляют собой многоклеточные трехмерные (3D) конструкции, которые лучше повторяют условия естественных условий, чем моноайеры клеток. Хотя они не могут полностью моделировать в естественных условиях сложности, они сохраняют некоторую функциональность оригинального органа. В моделях рака, органоиды обычно используются для изучения вторжения опухолевых клеток. Этот протокол направлен на разработку и характеристику органоидов из нормальной и облученных мышей молочной железы ткани для оценки радиационной реакции в нормальных тканях. Эти органоиды могут быть применены к будущему в пробирке рака исследований для оценки взаимодействия опухолевых клеток с облученных органоидов. Молочные железы были resected, облученных до 20 гр и усваивается в коллагеназы VIII раствора. Эпителиальные органоиды были отделены через центробежные дифференцировки, и 3D органоиды были разработаны в 96-хорошо низкой адгезии микропластин. Органоиды выразили характерный эпителиальный маркер цитокератина 14. Взаимодействие макрофагов с органоидами наблюдалось в экспериментах со-культуры. Эта модель может быть полезна при изучении опухолей-стромальных взаимодействий, инфильтрации иммунных клеток и поляризации макрофагов в облученном микроокружении.
Introduction
Примерно 60% от тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC) пациенты выбирают грудного сохранения терапии (BCT) в качестве одной из форм лечения1. В этом модальности лечения, опухоль, содержащая часть ткани молочной железы удаляется, и окружающие нормальные ткани подвергается воздействию ионизирующего излучения, чтобы убить любые остаточные опухолевые клетки. Лечение уменьшает рецидив в большей части населения рака молочной железы; Тем не менее, примерно 13,5% пациентов с TNBC опыт локализрегионарно рецидивов2. Таким образом, изучая, как излучение может набирать циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) приведет к важным понимание местных рецидивов3,4.
Предыдущая работа показала, что излучение нормальных тканей увеличивает набор различных типов клеток5. В доклинических моделях TNBC, облучение нормальных тканей увеличенного макрофага и впоследствии набора опухолевых клеток к нормальным тканям5. Иммунный статус повлиял на набор опухолевых клеток в облученных участках, с миграцией опухолевых клеток наблюдается у субъектов с ослабленным иммунитетом. Резюме этих взаимодействий с использованием органоидов, полученных из молочных желез позволит наблюдение клеточной миграции и клеток стромальных взаимодействий в режиме реального времени с микроскопией и живой визуализации клеток, чтобы определить роль радиационного повреждения в изменении поведение опухолевых клеток.
Органоиды молочных мышей помогли прояснить ключевые шаги в развитии молочной железы. Оргаоид молочной железы представляет собой многоклеточный, трехмерный конструкт изолированного молочной эпителия, который больше 50 мкм6,7,8,9,10. Используя первичные эпителиальные органоиды, Симиан и др. оценивали необходимые факторы для ветвления в молочной железе7. Шамир и др. обнаружили, что распространение может происходить без эпителиального мезенхимального перехода, обеспечивая понимание метастатического каскада8. Методы генерации и характеристики органоидов из ткани молочной железы хорошо созданы6,11,12,13. Однако, насколько нам известно, о методах выращивания облученных органоидов из молочных желез не сообщалось. Протокол для выращивания и характерирования облученных органоидов был бы критическим шагом в переподборе индуцированных радиацией иммунных и опухолевых клеток.
В данной статье мы сообщаем о методе выращивания и характеризующих облученных в низкоадгезиальных микропластиках молочных эпителиоидов, покрытых гидрофильным полимером, поддерживающего формирование сфероидов. Эти органоиды были совместно культивировали с макрофагами, чтобы изучить кинетику проникновения иммунной клетки. Эта работа может быть расширена за включение совместного культивирования органоиды с жировой клетки, чтобы резюмировать молочных характеристик, клетки рака молочной железы для визуализации опухоли клеток набора, и CD8 + т-клеток для изучения опухоли иммунных взаимодействий клеток. Ранее установленные протоколы могут использоваться для оценки облученных органоидов. Более ранние модели совместного культивирования молочных органоидов и иммунных клеток проливают свет на механизмы метастазов и распространения. Денардо и др. обнаружили, что CD4 + т-клеточной регуляции опухоли связанных макрофагов расширенной метастатического фенотипа молочной аденокарциномы14. Для выяснения механизмов биологического развития использовались также модели сокультуры. Плакс и др. уточнили роль CD4 + т-клеток в качестве регуляторов молочной оргагенеза15. Тем не менее, наша группа является первой, чтобы установить процедуру визуализации, как нормальное облучение тканей влияет на поведение иммунной клетки. Потому что нормальное облучение ткани было показано, что увеличить набор опухолевых клеток5, этот протокол может быть дополнительно разработан, чтобы проанализировать, как поведение опухолевых клеток изменяется путем облучения нормальных тканей и клеток, что приводит к большему пониманию рецидива рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Вандербильта.
1. Подготовка мышей и приобретение клеток (адаптировано из Нгуен-Нгок и др.11)
- Жертвоприношение athymic Nu/Nu мышей (8-10 недель) с использованием CO2 удушья следуют шейки дислокации. Очистите кожу, используя 70% этанола.
- Ресекта брюшной полости и паховых молочных желез от мышей, использующих предварительно стерилизованные ножницы и щипцы. Удаление лимфатических узлов перед резекцией. Промыть в стерильных 1x фосфатного буферного раствора (PBS) (рис. 1x).
- Поместите его в 15 мл трубки с 10 мл модифицированного орла СМИ Дульбекко/питательной смеси F12 (дмэм/F12) для транспортировки. Образцы могут храниться на ночь при температуре 4 °C или немедленно обрабатываться. Продолжайте лед.
- Облучают пробы на 20 гр с использованием источника цезия (рис. 1B).
- 45 мин после облучения, поместите молочные железы в стерильную пластину 35 мм и фарш с скальпелем (рис. 1C, D). Фарш с приблизительно 40 мазками до тех пор, пока ткань расслабляется и куски получаются, которые не больше, чем примерно 1 мм2 в области.
- Перенос на раствор коллагеназы в трубке центрифуги 50 мл. Раствор коллагеназы состоит из 2 мг/мл коллагеназы (см. таблицу материалов), 2 мг/мл трипсин, 5% v/v фетальной сыворотки (ФПС), 5 мкг/мл инсулина и 50 мкг/мл гентатацин в ДМЭМ/F12 СМИ. Используйте 10 мл раствора коллагеназы на мышь.
- Место в водяной бане при температуре 37 ° c, потряхивая каждые 10 минут за 30-60 мин. пищеварение завершено, когда раствор коллагеназы облачно (рис. 1E, F).
- Спин вниз переваривается раствор на 450 x g в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). Будут наблюдаться три слоя. Супернатант состоит из жира, средний слой является водный раствор, и дно гранул. Гранулы появятся красные, как это смесь эпителиальных клеток, отдельных стромальных клеток, и эритроцитов (Рисунок 1G).
- Препальто все пипетки, петалки советы, и центрифуги с бычьей сыворотки альбумин (БСА) решение до контакта. Раствор БСА состоит из 2,5 w/v% БСА в фосфат-буферном растворе Дулбекко (DPBS). Для предварительного покрытия, просто добавить затем удалить БСА решение внутри пипетки наконечник и трубы. Раствор БСА можно использовать повторно, хотя перед каждым экспериментом он должен быть стерильным фильтром.
- Для дополнительного восстановления перенесите супернатант на свежую ЗБТ с покрытием 15 мл трубки. Пипетки вверх и вниз энергично разогнать слой жира. Центрифуга на 450 x g в течение 10 минут на RT. аспирин supernatant, оставляя небольшое количество средств массовой информации в трубке, чтобы избежать аспеляции ячейки гранул.
- Аспоте в водный слой из трубки с оригинальной гранулами.
- Добавьте 10 мл ДМЕ/F12 в трубку с оригинальной гранулятом и переведите на вторую трубку. Пипетка энергично объединить и ресуспензируем двух гранул.
- Центрифуга на 450 x g в течение 10 минут на RT. АСК супернатант и добавить 4 мл ДМ/F12 в трубку.
- Добавьте 40 мкл дезокрибонуклеазы (Дназы) к подвеске и аккуратно встряхните вручную для 2-5 мин в растворе RT. Ddase состоит из 4 U/mL дназы в ДМЕМ/F12.
- Добавить 6 мл ДМЕ/F12 и пипетки тщательно. Центрифуга трубки на 450 x g в течение 10 минут на RT.
- Аспирин супернатант к отметке 0,5 ml. Ресуспензируем в 10 мл Дэм/F12 и пипетки тщательно.
- Пульс 450 x g и стоп 4 с после достижения этой скорости.
- Повторите шаги 1.16-1.17 еще три раза, чтобы очистить органоиды через центробежные дифференциации. Теперь гранулы должны быть небелым цветом, состоящим только из эпителиальных органоидов (рис. 1H).
Примечание: органоиды также могут быть отфильтрованы с использованием стерильных сеток 40 мкм фильтров. После шага 1,16, пипетки СМИ, содержащие органоиды через фильтр в центрифугу трубки, а затем промыть с 5 до 10 мл ДМ/F12 СМИ. Переверните фильтр по новой трубке центрифуги 50 mL. Pass 10 мл ДМ/F12 СМИ через, собирается противоположный способ смыть любой ретентат. Ретентат должен состоять из органоидов, а фильтрат должен состоять в основном из стромальных клеток, которые могут быть удалены или сохранены при желании.
2. Определение плотности и обшивки органоидов
- Ресуспензируем гранулы в 10 мл ДМЕ/F12. Пипетки тщательно, чтобы создать однородное решение.
- Перенесите 50 мкл на 30 мм чашку Петри и посмотрите под фазовый контрастный Микроскоп на 20x. Подсчитайте количество органоидов с подсчетом счетчика.
Примечание: здесь пипетки советы последовательно используются с минимальным диаметром 457 мкм, что составляет 5-10 раз диаметр органоидов, которые посеяны. Для переноса объемов 2 мл или более крупных (например, ступеней 1,16 и 2,1) используйте Серологические Пипетки с наконечником диаметром свыше 1 500 мкм. - Расчет плотности оргаоидов с использованием следующих уравнений:
Желаемая плотность составляет 1 000 органоидов/мл для упрощения дальнейшего разведения. Если плотность слишком низкая, центрифуга на 450 x g для 5 мин и АСК-медиа. Добавить средства массовой информации, необходимые для достижения 1 000 органоиды/мл, и пипетки тщательно для создания однородной смеси.- Для выращивания органоидов в белковой матрице, семенных органоидов при концентрации 1 органоид/л в коллаген типа 1 разбавленный до 87% или в подвале мембраны, извлеченные из Энгельбрета-холм-Роя мыши саркома. Во время работы с образцами, держать на льду.
- Для замораживания органоидов, передача желаемого объема в отдельную трубку центрифуги. Спин вниз на 450 x g для 5 мин. асспо, а затем добавить тот же объем 90% ФПС/10% ДДСО. Ресуспензируем органоиды, а затем Алиготе в криотрубок. Трансфер до-80 ° с, а затем до жидкого азота в течение одной недели.
- Для оттаивания, теплой в 37 °C водяной бане в течение одной минуты. Центрифуга в 450 x g в течение 5 минут, а затем аспирин замораживания средств массовой информации. Промыть стерильным DPBS, а затем снова центрифугу. Аспоте DPBS и добавить оргаоидных носителей.
- Пипетка 50 мкл (50 органоиды) в каждый колодец низкой пластины адгезии (рис. 1I).
- Добавьте 150 мкл органоидных носителей, чтобы довести общий объем работы до 200 мкл. Органоидные носители состоят из 1% пенициллина-стрептомицина и 1% инсулина-трансферрина-селена (его) в ДМЕМ/F12 Media.
- Каждые 2 дня тщательно заменяют средства массовой информации.
Примечание: низкое сцепление пластины не ткань культуры лечение; Таким образом, клетки могут быть легко отделены. Аспирин СМИ медленно наклона пластины и вставки наконечника пипетки на краю каждого хорошо. Оставьте небольшое количество носителей в нижней части колодца. Медленно добавляйте новые носители, чтобы избежать применения ненужных сил сдвига к органоиды.
3. co-культивирование с макрофагами
- Поддержание GFP или dTomato-помечены сырье 264,7 макрофаги в ДМЕМ СМИ дополнены 10% ФПС и 1% пенициллин-стрептомицин. Семян 1 х 104, 5 х 104, или 1 х 105 клеток/мл в оргаоидных носителей.
- Использование живых клеток фазы контраста и флуоресцентной визуализации для мониторинга проникновения макрофагов с течением времени.
4. иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов
Примечание: органоиды могут быть окрашены в низких скважин адгезии или могут быть переданы в камеры слайдов. Для передачи, аккуратно пипетки вверх и вниз, пока органоиды не отделились от пластин. Перемещение в камеры слайды и инкубировать для 4-8 h, чтобы позволить органоиды придерживаться поверхности пластины.
- Удалите органо-язычную среду из скважин путем тщательного ассерации. Fix образцов с 10% нейтральный буфер Формалин в течение 15 минут на RT.
- Вымойте 3x 5 мин в 1x PBS. При желании фиксированные образцы могут храниться при температуре 4 °C в течение одной недели для дальнейшего окрашивания.
- Проникая с 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-Теттраметилбутиля) фенил-полиэтиленгликоль за 5 мин.
Примечание: для окрашивания F-Actin, инкубации образцов с Фаллоидин разведенной 1:1000 и 1,67 Нм бисбензиммид ядерного красителя в 1% PBS/БСА для 1 ч в рт. Затем перейдите к шагу 4,8. - Берместебзе с 0,5 PBS. Образцы могут храниться в 4фоб изображениях и иммунофлуоресцентных изображениях. механизмы, которые вносят вклад в СТС rlock с 5% нормальный козьего сыворотки в 0,1% PBS/полиэтиленгликоль сорбитан моноорат (pmsk) для 1 ч на RT. Вымойте 3x 5 мин с PBS.
- Инкубировать с анти-цитокератин 14 разбавленный 1:1000, E-Кадхерин разбавленный 1:200, или плотный соединение белка один разбавленный 1:100 в 1% NGS в PMSK для 1 ч на RT. Вымойте 3x 5 мин в PMSK.
- Инкубировать с козьим анти-кролик вторичных разбавленных 1:200 с 1% NGS/PMSK для 1 ч в рт. Обложка с фольгой, чтобы избежать освещенности.
- Вымойте 3x 5 мин в PBS. Использование ядерного красителя (см. таблицу материалов), чтобы пятно ядер.
- Вымойте 3x 5 мин в PBS. При использовании камерного слайда, крепление с помощью комбинезона. Магазин, завернутый в фольгу при температуре 4 ° с на протяжении 2 недель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Облученных эпителиальных молочных органоидов были успешно получены из молочных желез мыши, обработанные, и культивировали на низко-адгезии пластин (рис. 1). Урожайность оргадоидов была протестирована посевом в различных средах роста (рисунок 2A-G). Посев клеток непосредственно на ткань культуры лечение 10 см пластин ячейки принесли разрастание фиброза клетки. Фибробласты были определены в рамках фазы контрастной микроскопии в пределах или вблизи той же плоскости фокус как органоиды, и они быстро выросли из покрытием органоиды в течение нескольких дней. Следствием фибробласты также наблюдалось, когда органоиды были посеяны в подвале мембраны и коллагеновых белков матрицы (рис 2E, F).
В оптимизации облученного органо-органного роста (рис.2H) были опробованы различные условия. Коллагеназы типов I и VIII из клостридии хистолитикум были использованы в качестве фермента в пищеварении органаид шаг12,16,17. Урожайность органаид была значительно выше после пищеварения с коллагеназы VIII. Это может быть связано с очистительные процессы, используемые в производстве фермента: коллагеназы типа я частично очищается и может привести к ненужным повреждениям мембранных белков и рецепторов, что приводит к образованию бедных органаидов, лизиса клеток, или над-пищеварение16 , 17 , 18. существенных различий в урожайности между облученных и контролируемым органоидами не наблюдалось.
Облученных органоидов можно культивировали в низких пластин адгезии (Рисунок 3A-C) или в пределах фундамента мембраны (Рисунок 3a-G), но наиболее быстрый рост произошел в низких пластин адгезии (Рисунок 3a). Органоиды, переприведенные характеристики молочных желез. Белые наконечники стрел показывают конструкции морфологически похожие на протоки и лепестки19, 20,21 (Рисунок 3c), которые имеют решающее значение для производства и транспортировки молока в молочной железе21. Однако для подтверждения этого замечания требуется дальнейшая характеристика. Тенденции роста показали, что необлученных органоидов росли быстрее, чем облученных органоидов (Рисунок 3H), скорее всего, из-за ареста роста клеток в результате механизмов репарации повреждений ДНК; Однако эта тенденция не является статистически значимой22. Отмечались случайные скопления низкоадгезионной органоидов, а органоиды могли культивировать до двух недель до дисотделения.
Органоиды выраженные эпителиальные характеристики, которые были оценены через иммунофлуоресцентное окрашивание цитокератина 14 (K14), e-кадхерин (e-CAD), и плотный соединение протеин 1 (ZO-1)23,24,25 ( Рисунок 4). Облученных органоидов выразили эпителиальные маркеры. K14, маркер миоэпителия23, был выражен сильно на поверхности облученных органоидов (рис. 4A). Кроме того, E-CAD и ZO-1 были выражены в клеточных соединениях органоидов (рис. 4B, C). Эти белки необходимы для правильной клеточной адгезии24. После облучения органоиды продолжали сохранять свои эпителиальные характеристики.
Люминесцентное окрашивание органоидов может быть визуализирована в низких пластин адгезии с использованием флуоресцентной микроскопии (Рисунок 5A-D); Однако наиболее четкое визуальное представление было получено с помощью конфокальной микроскопии (Диаграмма 5e-F). Исправленная общая интенсивность флуоресценции была рассчитана путем вычитания фона и нормализации по органоидной области (Рисунок 5G). Растущие органоиды в 96-well низких тарелках адгезии также упростили эксперименты Co-культуры. При посев в концентрациях, типичных для молочной железы, макрофаги солокализованы с контролируемой и облученных органоидами (рис. 6)24,26.
На рисунке 1. Метод документооборота. A) молочные железы были резектированы у мышей. Использовались брюшные и паховые молочные железы. (B) молочные железы были облучены в 50 ml центрифуг труб, содержащих ДМ/F12 СМИ. (С) молочные железы были переданы стерильные шесть-хорошо пластин и вырезать с хирургическими скальпели, пока фарш (D). (E) молочные железы были переданы в 50 ml центрифужные трубы, содержащие 5 мл стерильных ДМЭМ/F12 СМИ на железе и перевариваются в коллагеназы VIII раствор (F). (G) после перевода на трубку 15 мл, центробежная дифференциация была использована для удаления стромальных клеток, одиночные клетки, и эритроциты, наблюдается в красных гранул (белая стрелка головы), пока только белые эпителиальные органоиды были получены (H ). (I). 50 органоиды были покрыты в 200 мкл средств массовой информации в 96-хорошо низкие пластины адгезии и отображаемого с использованием фазы контрастной микроскопии шкала полоса представляет собой 50 мкм. пожалуйста, щелкните здесь для просмотра более крупной версии этой фигуры.
Рисунке 2. Оргаоид обшивка в 3D белковых матриц и ткани культуры обработанные пластиковые. Органоиды, высеяны в коллагене (A) и базальной мембране (B), отображаемого после 84 часов роста. Результат фибробласты произошел в матричных органоидов (C, D). Фазовые контрастные изображения органоидов, отсортированных через фильтрацию, были получены через 192 часов после посева. Не наблюдалось каких-либо серьезных различий между фильтратом (е) и Реттаритом (F), что привело к беглом росту фиброза. Клетки в E и F были посеяны на тканевой культуре обработали пластик. После трипонизации в течение 5 минут на RT, фибробласты были удалены через аспирация; Однако оставшиеся эпителиальные клетки образовали монослообразную культуру вместо трехмерных органоидов (г). Шкала баров для A-G представляет 100 мкм. (H) различные типы КОЛЛАГЕНАЗЫ (I (CI) и VIII (CVIII)) и методы обработки клеток (фильтрация и центробежная дифференциация (цент дифф)) были протестированы, и металлообрабатывающий урожай на молочную железу был количественно (n = 2 железы для CI, фильтр; 2 железы для CVIII, фильтр; 4 железы для CI, цент дифф, и 12 желез для CVIII, цент дифф). Статистическая значимость определялась с использованием двуххвостых, непарных т-тестов, * * * p < 0.0001. Бары ошибок представляют стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунке 3. Репрезентативный Оргаоид роста. Фазовые контрастные изображения с облученного органевидного роста в низких пластин адгезии получили 20 (A), 44 (B) и 106 (C) часов после посева. Белые наконечники стрел обозначают структуры, похожие на морфологию протоков и долей. Фазовые контрастные изображения с облученного органевидного роста в базальной мембране получены 42 (D), 66 (E), 60 (F) и 114 (G) часов после посева. Шкала баров представляют 50 мкм. H. Измерение площади было получено в различных условиях роста: органоиды, сразу же посеяны после пищеварения и сортировки (облученных (●), Control (▪)), и органоиды,высеяны в базальной мембране (облученный (), контроль (□)) (n = 3 желез каждый). Расчеты по площади проводились с использованием программного обеспечения Iiiej. Бары ошибок представляют стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
На рисунке 4. Выражение эпителиального маркера на облученных органоидов. Цитокератин 14 (K14, зеленый), маркер для базального слоя плоскоклеточный и не-плоскоклеточный эмбриона, был выражен на облученных органоидов (а). E-кадхерин (E-CAD), протеин необходимый для адгезии, был выражен внутри соединения между клетками в облученных органоидов (B). Тугие соединения белка один (ZO-1) также выражается в клеточных соединениях облученных органоидов (C). Изображения были получены в камерных слайдах с помощью конфокальной микроскопии. Нуклеиновых кислот пятно было использовано для визуализации ядер (синий). Все органоиды были фиксированными и отображаемого после одной недели роста. Шкала баров 50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
На рисунке 5. Экспрессия F-Actin в органоидов. F-Actin (красный), микронити в эпителиальных клетках, выражалась с меньшей интенсивностью в необлученных органоидов (a, C, E), чем в облученных (B, D, F) органоиды. Нуклеиновых кислот пятно было использовано для визуализации ядер (синий). Изображения были взяты на низкой адгезии 96-хорошо пластин (A, B) и 16-хорошо камерных слайдов (C, D). Изображения были также взяты с помощью конфокальной микроскопии (E, F). Все органоиды были фиксированными и отображаемого после одной недели роста. Шкала баров 50 мкм. г. Фаллоидин флуоресцентных данных из низких пластин адгезии изображения были количественно в Iiiej (n = 3 желез). Бары ошибок указывают на стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
На рисунке 6. Оценка взаимодействия клеток-клеток с помощью макрофаганного оргадоида со-культуры. Макрофаги (красный) проникли контроля (а) и облученных (б) органоиды. Шкала баров составляют 50 мкм. Средняя процентная площадь макрофагов в поле изображения (C) была сообщены на 24 часах Co-культуры для управления (желтого цвета) и облученных (померанцовых) органоидов (n = 3 железы для каждого образца). Макрофаги были посеяны в концентрациях 10 000 клеток/мл, 50 000 клеток/мл и 100 000 клеток/мл, и их проникновение было захвачено каждые 30 минут через живую ячейку флуоресцентной визуализации. Все эксперименты со-культуры начались через 7 дней после посева начального оргаоида. Статистическая значимость определялась с использованием двуххвостых, непарных т-тестов, * p < 0, * * * p < 0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы разработали метод воспроизводимых темпов роста и характеризации облученных молочных органоидов (рис. 1). Доза облучения 20 гр был применен для зеркала предыдущего в естественных условиях модели набора опухолевых клеток5. Облучение молочных желез ex естественных условиях до формирования оргаоида позволило для изоляции эффектов радиационного поражения без соответствующего проникновения иммунных клеток. Развитие в пробирке облученных нормальной модели ткани позволяет в режиме реального времени просмотра клеточных взаимодействий, которые могут способствовать излучения индуцированной КТК набора11,12.
Внимательно следуя шагам 1.5-1.18 имеет решающее значение для максимизации урожайности оргадоидов. Мы добавили талые аликвотов концентрированного коллагеназы к пищеварительному растворе. Из-за высокой вязкой природы концентрированного коллагеназы aliquot, могут быть некоторые изменения в количестве и, следовательно, в ферментативной деятельности, так что оргаоидных пищеварение должно быть тщательно контролируется, чтобы избежать перепищеварения. Важно также, чтобы переварить органоиды в 50 mL трубки, поскольку это позволяет даже площадь поверхности для пищеварения. Другие исследования использовали фильтрацию для очистки органоидов19,23; Тем не менее, мы получили гораздо более высокую урожайность очистки с центробежная дифференциация (Рисунок 2H). Для максимизации урожайности необходимо предварительное покрытие, пипетки, наконечники труб и центрифужные трубки с раствором БСА. Органоиды заметно придерживаются непокрытых пластика, когда решение приложения пренебречь.
Необходимо позаботиться о том, чтобы избежать АСС-органоидов. Это риск, который возникает при очищении, изменении носителя и окрашивании флуоресцентных маркеров. Использование низких пластин адгезии для роста позволяет легко передавать органоиды и устраняет необходимость в органоиды, чтобы быть секционные в октябре для дальнейшего окрашивания, процедура, необходимая для подвала мембраны встроенных органоидов11. В дополнение к преимуществам от превосходного роста, посевной облученных органоидов в низких пластин адгезии требуется меньшее количество шагов и был менее технически сложным, чем культивирования органоиды в подвале мембраны или коллагена. Однако, когда окрашивание для маркеров, это может быть полезно для просмотра органоидов под микроскопом, чтобы гарантировать, что случайное стремление не происходит.
Кроме того, есть много соображений, которые должны учитываться при визуализации органоиды. Внутри фундамента мембраны встроенных органоидов, случайный рост фиброза может наблюдаться (Рисунок 2C, D). Фибродоменная рост в 3D культивируемые органоиды могут быть вызваны органоиды, делая контакт с культурой ткани обработанные поверхности, как адгезия приводит к upregulated производство фактора роста фиброза в адепт клетки27. Интересно, что морфология этих фибробласты поразительно похожа на предадипоциты, так как оба типа клеток проявляют тонкими, удлиненные формы28. При дальнейшем исследовании воздействие инсулина, дексаметазона и 3-изобутиля-1-метилксантина (ИБМХ) может привести к формированию клеток с адипогенной линией, что стимулирует переход к более сферической клеточной форме, связанной с адипоцитами28, 29. Мы получили четкие изображения с использованием фазово-контрастной микроскопии свободно растущей низкой адгезии (рис. 3-с) и встраиваемых фундамента мембраны (рис. 3a-G) органоиды. Отслеживание индивидуального роста органо в низких пластин адгезии, однако, было трудно из-за минимального фокусных спаек между клетками и хорошо поверхности, что приводит к органо движения и случайные стремления.
После окрашенных для поверхностных маркеров, конфокальная микроскопия более четкую локализацию маркер (Рисунок 5E, F), чем широкополосная микроскопия (Рисунок 5e-D). Из количественной оценки флуоресценции, тенденции в выражении Фаллоидин свидетельствуют о том, что облученный органоиды, выраженные F-Actin относительно контроля (Рисунок 5G). Актин цитоскелетон реорганизация наблюдалась в кожных микрососудистых эндотелиальных клеток, облученных в аналогичных дозах30.
Для расширенных последовательностей изображений, как промежуток времени Co-культура с иммунными клетками (Рисунок 6), живая камера камеры визуализации с влажностью и CO2 Control требуется31. Живые Сотовые изображения, взятые каждые 30 минут, показали, что макрофаги солокализованы с органоидами после 24 часов (Рисунок 6A, B), преимущественно мигрируя в сторону облученных органоидов (Рисунок 6a). Макрофагов инфильтрации в облученных нормальных тканей наблюдается в естественных условиях, приписывается хемокинов и цитокина градиентов, и, как правило предшествует КТК набора5. Будущие исследования будут оценивать классически и альтернативно активированных взаимодействий макрофагов с органоиды как поляризованные макрофаги динамика может играть важную роль в определении ответа на радиацию32,33. Дополнительные анализы будут оценивать последствия сывороточного голодания и роста эффектов культивирования органоидов в полных СМИ, так как эти переменные могут иметь существенное влияние на органоид-иммунных взаимодействий клеток. Эта система может быть адаптирована для совместной культуры с другими типами клеток, в том числе CD8 + т-клеток, стромальных клеток, адипоцитов и раковых клеток молочной железы. Наблюдение в режиме реального времени с помощью таких методов, как живая клеточная визуализация, облегчит процесс выяснения потенциальных механизмов, способствующих набору КТК для облученных нормальных тканей, что может иметь существенные последствия для пациентов, страдающих от рецидивирующих ТНРМЖ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Лаура л. Бронсар для обеспечения GFP и Dтомат-помечены RAW 264,7 макрофагов. Это исследование было финансово поддержано субсидии низ #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
References
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H.
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
- Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S.
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
