Summary
Fare meme bezlerinden geliştirilen organoidler ışınlanmış ve epitelyal özellikleri ve immün hücrelerle etkileşimleri değerlendirmek için karakterize edilmiştir. Işınlanmış organoids daha iyi radyal normal dokuda tümör hücre işe neden olabilir hücre hücre etkileşimleri değerlendirmek için kullanılabilir.
Abstract
Sindirilmiş dokudan elde edilen organoidler çok hücreli üç boyutlu (3D) daha iyi hücre monolayerlere kıyasla vivo koşullarda özetlemek yapıları vardır. Tamamen içinde vivo karmaşıklık modeli olamaz rağmen, onlar orijinal organ bazı işlevselliği korumak. Kanser modellerinde, organoids yaygın tümör hücre istilası çalışmak için kullanılır. Bu protokol, normal dokularda radyasyon tepkisi değerlendirmek için normal ve ışınlanmış fare meme bezi dokusu organoids geliştirmek ve karakterize amaçlamaktadır. Bu organoidler, radyasyonlu organoidlerle tümör hücresi etkileşimlerini değerlendirmek için gelecekteki in vitro kanser çalışmalarına uygulanabilir. Mammary bezleri, 20 GY 'ye ışınlanmış ve kolajenaz VIII çözeltisi içinde sindirilmiş, rezeke edildi. Epitelyal organoidler Santrifüjlü farklılaşma yoluyla ayrıldı ve 96-iyi düşük yapışkanlık mikroplaklarda 3D organoidler geliştirilmiştir. Organoids karakteristik epitelyal Marker Sito 14 ifade. Ortak kültür deneylerinde organoidlerle makrophaj etkileşimi gözlenmiştir. Bu model tümör-stromal etkileşimleri, bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu ve radyasyonlu bir mikroçevre içinde makrophaj polarizasyon okumak için yararlı olabilir.
Introduction
Üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hastalarının yaklaşık% 60 ' i meme arıtma terapisi (BCT) tedavi formu olarak seçilir1. Bu tedavi modalitesi, meme dokusunun bir kısmını içeren tümör kaldırılır, ve çevredeki normal doku herhangi bir kalıntı tümör hücrelerini öldürmek için iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalır. Tedavi meme kanseri nüfusunun çoğunu tekrarı azaltır; Ancak TNBC ile tedavi edilen hastaların yaklaşık% 13,5 ' si, bölgesel nüks2. Bu nedenle, radyasyonun nasıl dolaşabilir tümör hücrelerini (ctcs) araştırarak yerel nüks3,4içine önemli anlayışlar yol açacaktır.
Önceki çalışma normal doku radyasyonun çeşitli hücre türleri işe artırdığını göstermiştir5. TNBC 'nin klinik öncesi modellerinde, normal dokuların ışınlanması makrophaj ve sonra tümör hücresi alımı normal dokulara5' e yükseldi. İmmün durum bağışıklık sistemi etkilenen konularda gözlenen tümör hücre göç ile, ışınlanmış sitelere tümör hücre işe etkilediği. Meme bezlerinden elde edilen organoidleri kullanarak bu etkileşimlerin reapitasyonu, hücre göçü ve hücre-stromal etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak mikroskopi ve canlı hücre görüntüleme ile gözlemlemek, radyasyon hasarının rolünü belirlemek için tümör hücre davranışı.
Fare meme organoids Meme bezinin gelişiminde önemli adımlar aydınlatmak yardımcı oldu. Bir meme nevuslardır, 50 μm6,7,8,9,10' dan daha büyük olan yalıtılmış meme epitelin bir çok hücreli, üç boyutlu yapısıdır. Primer epitelyal organoidleri kullanarak, Simian ve al. meme bezinde dallanma için gerekli faktörler değerlendirildi7. Shamir ve ark. yaygınlaştırma, epitelyal geçiş için epitel olmadan ortaya çıkabilir, metastaz Cascade8içine anlayış sağlayan keşfetti. Meme bezi dokusundan organoidlerin oluşturulması ve karakterize edilmesi için yöntemler iyi kurulmuştur6,11,12,13. Ancak, bilgimize, meme bezlerinden ışınlanmış organoidlerin büyüyen yöntemleri bildirilmemiştir. Radyasyon kaynaklı bağışıklık ve tümör hücresi işe alma reapitulating için bir protokol büyüyen ve ışınlanmış organoids karakterize için kritik bir adım olacaktır.
Bu yazıda, küre oluşumunu destekleyen bir hidrofilik polimer ile kaplı düşük yapışkanlık mikroplaklarda ışınlanmış meme epitelyal organoidleri büyüyen ve karakterize etmek için bir yöntem bildiriyoruz. Bu organoidler, immün hücre infiltrasyonu kinetiği incelemek için makrofajlar ile birlikte Kültürlenmiş. Bu çalışma, meme özellikleri, göğüs kanseri hücrelerinin tümör hücre işe alma görselleştirmek için adipoz hücreleri ile Co-kültürü organoids dahil etmek için genişletilebilir ve tümör-immün hücre etkileşimlerini incelemek için CD8 + T hücreleri. Daha önce kurulan protokoller ışınlanmış organoidleri değerlendirmek için kullanılabilir. Önceki modeller meme organoidleri ve bağışıklık hücrelerinin ortak kültür metastaz ve yayma mekanizmaları ışık dökmeye. DeNardo ve al. bu CD4 + T hücre yönetmeliğinin ilişkili makrofajlar meme adenokarsinomların metastatik phenoype geliştirilmiş bulundu14. Co-kültür modelleri de biyolojik gelişim mekanizmaları aydınlatmak için kullanılmıştır. Plaks ve ark., meme organogenezi15' in aşağı regülatörleri olarak CD4 + T hücrelerinin rolünü açıklığa kavuşturuldu. Ancak, grubumuz normal doku ışınlarının bağışıklık hücresi davranışlarını nasıl etkilediğini görselleştirerek ilk kez bir prosedür oluşturmaktır. Çünkü normal doku ışınlama tümör hücre işe alma geliştirmek için gösterilmiştir5, bu protokol daha büyük bir anlayış önde gelen, normal doku ve hücrelerin radyasyon ile nasıl değişmiş tümör hücre davranışını analiz etmek için geliştirilmiş olabilir Kanser nüks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışmaları, Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanan kurumsal yönergeler ve protokollere uygun olarak yapılmıştır.
1. fareler ve hücre alımı hazırlanması (Nguyen-Ngoc ve al.11uyarlanmıştır)
- Co2 boğulma kullanarak atymic Nu/nu fareler (8-10 hafta eski) kurban servikal dislocation takip. 70% etanol kullanarak cildi temizleyin.
- Ön sterilize makas ve forseps kullanarak farelerden karın ve inguinal meme bezlerini RESECT. Rezeksiyondan önce lenf nodları çıkarın. Steril 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde durulayın (Şekil 1a).
- 15 mL borular ile yerleştirin 10 mL Dulbecco 's modifiye kartal medya/besin karışımı F12 (DMEM/F12) taşıma için. Numuneler gece 4 °C ' de muhafaza edilebilir veya hemen işlenir. Buzdan devam et.
- Bir sezyum kaynağı kullanarak 20 GY 'de radyasyon örnekleri (Şekil 1B).
- 45 min ışınladıktan sonra, 35 mm Steril hücre plakasında meme bezlerini yerleştirin ve neşter ile kıyma (Şekil 1C, D). Yaklaşık 40 strok ile Mince doku rahatlatır ve parçalar yaklaşık 1 mm2 alanda daha büyük olan elde edilir kadar.
- 50 ml santrifüj tüpünde kolajenaz çözüme aktarın. Kolajenaz çözeltisi oluşur 2 mg/ml kolajenaz (bkz. malzeme tablosu), 2 mg/ml tripsin, 5% v/v fetal Sığır serum (FBS), 5 μg/ml insülin, ve 50 μg/ml gentaminisin dmem/F12 medya. Fare başına 10 ml kolajenaz çözümünü kullanın.
- 37 °c ' de bir su banyosuna yerleştirin, her 10 dakikada bir 30-60 dk için vortekslenir. kolajenaz çözeltisi bulutlu olduğunda sindirim tamamlanır (Şekil 1E, F).
- 450 x g 'de, Oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 10 dakika boyunca sindirilmiş solüsyonu aşağı döndürün. Üç katman gözlenir. Süpernatant yağ oluşur, orta tabaka sulu bir çözümdür, ve alt bir Pelet olduğunu. Bu epitelyal hücrelerin bir karışımı olduğu gibi Pelet kırmızı görünecektir, bireysel stromal hücreler, ve kırmızı kan hücreleri (Şekil 1G).
- Tüm Pipetler, pipet uçları ve Santrifüjlü tüpleri, temas etmeden önce Sığır serum albümin (BSA) çözeltisi ile önkat. BSA çözeltisi, Dulbecco fosfat tampon tuzlu (DPBS) 2,5 w/v% BSA oluşur. Ön kaplama için, sadece sonra pipet ucu ve tüpler içine BSA solüsyonu kaldırmak ekleyin. Her denemede steril olmalıdır, ancak BSA çözüm yeniden kullanılabilir.
- Ek iyileşme için, süpernatant taze bir BSA kaplı 15 ml tüp aktarın. Pipet yukarı ve aşağı şiddetle yağ tabakası dağıtmak için. 450 x g 'de santrifüjler, RT 'de 10 dk. supernatant aspirate, hücre Pelet duman çekiş önlemek için tüp medya küçük bir miktar bırakarak.
- Orijinal Pellet ile tüpten sulu tabaka aspirate.
- Orijinal Pelet ile tüp için dmem/F12 10 ml ekleyin ve ikinci tüp transfer. Pipette, iki Pelet birleştirmek ve yeniden pelletini için şiddetle.
- 450 x g 'de santrifüjte 10 dk. süpernatant aspirate ve tüp 4 ml dmem/F12 ekleyin.
- 40 μL deoksiribonükleaz (DNase) için süspansiyona ekleyin ve RT. DNase çözeltisi içinde 2-5 dk için yavaşça elle sallamak dmem/F12 4 U/ml DNase oluşur.
- 6 mL DMEM/F12 ve pipet iyice ekleyin. Tüp Santrifüjü 450 x g 'de 10 dakıka boyunca RT.
- 0,5 ml işaretine süpernatant aspirate. Resuspend 10 mL DMEM/F12 ve pipet iyice.
- Nabız 450 x g ve stop 4 s bu hıza ulaştıktan sonra.
- Adım 1.16-1.17 üç kez daha santrifüj farklılaşma yoluyla organoidleri arındırmak için yineleyin. Pelet artık sadece epitelyal organoidlerden oluşan kapalı-beyaz bir renk olmalıdır (Şekil 1s).
Not: Organoids Ayrıca steril Mesh 40 μm filtreleri kullanılarak filtrelenebilir. Adım 1,16 sonra, bir santrifüj tüpüne bir filtre aracılığıyla organoids içeren pipet medya ve sonra 5 ila 10 mL DMEM/F12 medya ile durulayın. Yeni 50 mL santrifüj tüpünün üzerine filtreyi çevirin. Pass 10 mL DMEM/F12 medya üzerinden, herhangi bir retentate durulamak için ters şekilde gidiyor. Retentat organoidler oluşmalıdır, ve filtrat özellikle atılabilir veya istenirse tutulan stromal hücrelerin, oluşmalıdır.
2. yoğunluk ve kaplama organoidlerin belirlenmesi
- 10 ml dmem/F12 resuspend Pelet. Homojen bir çözüm oluşturmak için pipet iyice.
- 50 μL 'ye transfer 30 mm Petri tabağı ve 20X 'de faz kontrast mikroskobu altında görüntüleyin. Bir sayım sayacı ile organoids sayısını saymak.
Not: burada pipet uçları, en az 457 μm çap ile tutarlı bir şekilde kullanılmıştır ve bu da tohum organoidlerin 5-10 kat çapıdır. 2 mL veya daha büyük hacimleri aktarmak için (örn. 1,16 ve 2,1 basamakları), 1.500 μm den fazla uç çapıyla serolojik pipetler kullanın. - Aşağıdaki denklemini kullanarak nevuslardır yoğunluğunu hesaplayın:
İstenen yoğunluk 1.000 daha fazla seyreltme basitleştirmek için organoids/mL olduğunu. Yoğunluk çok düşükse, 5 dk ve Aspire medya için 450 x g Santrifüjü. 1.000 organoids/mL ulaşmak için gerekli medya ekleyin ve homojen bir karışım oluşturmak için iyice pipet.- Bir protein matrisinde organoidler büyümek için, 1 organoid/L kollajen tip 1 konsantrasyonunda tohum organoidler% 87 veya Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu çıkarılan Bodrum membranda seyreltilmiş. Örneklerle çalışırken buz üzerinde tutun.
- Organoidleri dondurmak için, istenilen hacmi ayrı bir santrifüj tüpüne aktarın. 5 dk. Aspirate medya için 450 x g aşağı spin ve sonra aynı hacim eklemek 90% FBS/10% DMSO. Organoids yeniden resuspend, ve sonra cryotubes içine kısım. -80 °C ' ye transfer ve sonra bir hafta içinde sıvı nitrojen.
- Bir dakika için 37 °c ' lik su banyosunda ısıtmak için bir dk. 5 dakika için 450 x g Santrifüjü ve sonra donma ortamını Aspire. Steril DPBS ile durulayın ve sonra tekrar santrifüjün. Dpbs aspirate ve nevuslardır medya ekleyin.
- Pipet 50 μL (50 organoids) düşük yapışma plakasının her bir kuyusu içine (Şekil 1I).
- Toplam çalışma hacmini 200 μL 'ye getirmek için 150 μL nevuslardır medya ekleyin. nevuslardır medya 1% penisilin-streptomisin ve 1% insülin-transferrin-selenyum (onun) dmem/F12 medyada oluşur.
- Her 2 günde bir medyayı dikkatlice değiştirin.
Not: düşük yapışma plakaları tedavi doku kültürü değildir; Bu nedenle, hücreler kolaylıkla ayrılabilir. Plakayı eğerek ve her bir kuyu kenarına Pipet ucunu takarak medyayı yavaşça aspirate. Kuyu altında medya küçük bir miktar bırakın. Organoidlere gereksiz kesme güçleri uygulamadan kaçınmak için yavaşça yeni medya ekleyin.
3. makrofajlar ile birlikte kültür
- % 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenen DMEM medyada GFP veya dTomato etiketli RAW 264,7 macrofajlar koruyun. Tohum 1 x 104, 5 x 104, veya 1 x 105 hücreler/ml nevuslardır medya içine.
- Zaman içinde makrophaj infiltrasyonu izlemek için canlı hücre faz kontrastı ve floresan görüntüleme kullanın.
4. organoids immünofluorescence boyama
Not: Organoids düşük yapışma kuyuları içinde lekelenmiş olabilir veya oda slaytlarına transfer edilebilir. Transfer etmek için, organoidler plakalardan ayrılıncaya kadar yavaşça yukarı ve aşağı pipet çıkarın. Oda kaydıraklarına transfer ve 4-8 h için inkük, organoidlerin plaka yüzeyine uymasına izin verir.
- Dikkatle aspirating tarafından kuyulardan nevuslardır orta çıkarın. RT 'de 15 dakika boyunca% 10 nötr tampon formalin ile örnekleri düzeltin.
- 1x PBS 'de 3x 5 dk yıkayın. İstenirse, sabit numuneler daha fazla boyama için bir hafta boyunca 4 °C ' de depolanabilir.
- 5 dakika boyunca 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-Tetramethylbutyl) fenil-Polietilen glikol ile geçirgen.
Not: F-actin için leke Için, phalloidin seyreltilmiş 1:1000 ve 1,67 nM bisbenzimid nükleer boya 1% PBS/BSA içinde RT 1 h için numuneleri inkük. Ardından, 4,8 adıma geçin. - 0.5 PBS ile bermeabilize. Örnekler 4opy görüntülerinde ve immünofluorescent görüntülerde depolanabilir. 0,1% PBS/Polietilen glikol Sorbitan monolaurat (PBST) içinde% 5 normal keçi serumu ile CTC RLOCK 'a katkıda bulunan mekanizmalar, RT 'de 1 h. yıkama 3x 5 dk
- Anti-Siteratin ile inküye 14 seyreltilmiş 1:1000, E-cadherin seyreltilmiş 1:200, veya sıkı kavşak proteini bir seyreltilmiş 1:100 1% NGS içinde PBST 1 h için RT. yıkama 3x 5 dakika PBST.
- Keçi karşıtı ikinci seyreltilmiş 1:200, RT 'de 1 h için 1% NGS/PBST ile kulkaylar. ışık maruz kalma önlemek için folyo ile kapak.
- PBS 'de 3x 5 dakika yıkayın. Çekirdekleri leke için nükleer boya ( malzeme tablosunabakın) kullanın.
- PBS 'de 3x 5 dakika yıkayın. Eğer oda kaydırağı kullanıyorsanız, bir coverslip ile monte edin. 2 haftaya kadar 4 °C ' de folyoyla sarılmış mağaza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Radyasyonlu epitelyal meme organoidler, fare meme bezlerinden başarıyla elde edildi, işlenmiş ve düşük yapışkanlık plaklarda kültürlü (Şekil 1). Organoid verim farklı büyüme ortamlarında tohumlama ile test edildi (Şekil 2a-G). 10 cm hücreli plakalı tedavi edilen doku kültürünü doğrudan tohumlama hücreleri fibroblast hücrelerinin bir aşırı büyümesini sağladı. Fibroblastlar, organoidler olarak aynı odak düzleminde veya yakın faz kontrast mikroskobu altında tespit edildi ve hızla birkaç gün içinde kaplama organoidler büyüdü. Organoidlerin Bodrum membranında ve kollajen proteini Matrislerinde (Şekil 2E, F) doğduğunda fibroblastların büyümesi de gözlenmiştir.
Işınlanmış nevuslardır büyümesini optimize etmek için çeşitli koşullar test edildi (Şekil 2H). Kolagenaz türleri ı ve VIII Clostridium histolyticum nevuslardır sindirim adımda enzim olarak kullanıldı12,16,17. Organoid verimleri kolajenaz VIII ile sindirim sonrası önemli ölçüde daha yüksektir. Bu enzim üretiminde kullanılan arıtma süreçleri nedeniyle olabilir: kolajenaz tipi kısmen saflaştırılır ve membran proteinleri ve reseptörlerine gereksiz hasara neden olabilir, yoksul nevuslardır oluşumuna yol açan, hücre lizis, veya aşırı sindirim16 , 17 , 18. ışınlanmış ve kontrol organoidler arasındaki verimde önemli farklılıklar gözlenmiştir.
Işınlanmış organoidler düşük yapışma plakaları (Şekil 3A-C) veya Bodrum membran (şekil 3D-G) içinde kültürlü olabilir, ancak en hızlı büyüme düşük yapışma plakaları (Şekil 3H) oluştu. Organoids reapitüle meme bezi özellikleri. Beyaz ok uçları, meme bezi21' de süt üretimi ve taşınması için kritik olan kanallar ve loblar19, 20,21 (Şekil 3c), morfolojik olarak benzer yapıları gösterir. Ancak, bu gözlem onaylamak için daha fazla karakterizasyon gereklidir. Büyüme trendleri radyasyon olmayan organoidlerin radyasyonlu organoidlerden daha hızlı büyüdüğünü belirtmektedir (Şekil 3H), büyük olasılıkla DNA hasar onarımı mekanizmalarından kaynaklanan hücre büyüme tutuklaması nedeniyle; Ancak, eğilim istatistiksel olarak önemli değildi22. Düşük yapışma organoidlerin zaman zaman küplüğü gözlenmiştir, ve organoidler dağılmadan önce iki hafta kadar kültürlü olabilir.
Organoidler epitelyal karakteristikleri ifade ederek, sitonatin 14 (K14), e-cadherin (e-CAD) ve sıkı kavşak proteini 1 (zo-1)23,24,25 ( Şekil 4). Radyasyonlu organoids epitelyal belirteçleri ifade etti. K14, myoepitelyum23' ün bir belirteci, ışınlanmış organoidlerin yüzeyine güçlü bir şekilde ifade edildi (Şekil 4A). Ayrıca, E-CAD ve ZO-1, organoidlerin hücresel kavşaları içinde ifade edildi (Şekil 4b, C). Bu proteinler uygun hücre yapışma için gereklidir24. Radyasyon sonra, organoids epitelyal özelliklerini korumak için devam etti.
Floresan mikroskopisi (Şekil 5A-D) kullanılarak düşük yapışma plakaları içinde organoidlerin flüoresan lekeleri görüntülenebilir; Ancak, en net görselleştirme konfokk mikroskobu ile elde edildi (Şekil 5E-F). Düzeltilmiş toplam floresan yoğunluğu, arka planı çıkararak ve nevuslardır alanı normalleştirilerek hesaplanır (Şekil 5g). 96-iyi düşük yapışma plakaları içinde büyüyen organoids da Co-kültür deneyler basitleştirilmiştir. Meme bezinde tipik konsantrasyonlarda dikme sırasında (Şekil 6)24,26, kontrol ve ışınlanmış organoidlerle birlikte lokalize macrofajlar.
Şekil 1. Yöntem Iş akışı. (A) meme bezleri farelerden rezeke edildi. Abdominal ve inguinal meme bezleri kullanılmıştır. (B) dmem/F12 medya Içeren 50 ml santrifüjli tüplerde meme bezleri ışınlanmış. (C) mammary bezleri steril altı-kuyu plakalarına transfer edildi ve kıyılmış (D) kadar Cerrahi neşter ile kesilmiş. (E) meme bezleri, bezi başına 5 ml steril dmem/F12 ortamı içeren ve bir kolajenaz VIII çözeltisi (F) sindirilmiş 50 ml Santrifüjlü tüplere transfer edildi. (G) 15 ml 'lik bir tüpe aktarıldıktan sonra, stromal hücreleri, tek hücreleri ve kırmızı kan hücrelerini kaldırmak için, sadece beyaz epitelyal organoidler elde edilinceye kadar kırmızı bir Pelet (beyaz ok kafası) olarak gözlenen Santrifüjlü farklılaşma kullanılmıştır (H ). (I). 50 organoidler, 96-iyi düşük yapışma plakalarının 200 μL 'de kaplanmıştır ve faz kontrast mikroskopisi kullanılarak görüntülenmiş scale bar, 50 μm ' yi temsil eder. bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 2. 3D protein matrisleri ve doku kültürü üzerinde organoid Kaplama plastik tedavi. Kollajen (A) ve Bodrum membranı (B), 84 saat sonra görüntülenmiş organoids büyüme. Matris kaplama organoidlerde (C, D) fibroblastların gelişimi ortaya çıktı. Filtrasyon yoluyla sıralanan organoidlerin faz kontrast görüntüleri, tohumlama işleminden 192 saat sonra elde edilmiştir. Filtrat (E) ve retentat (F) arasındaki önemli farklar gözlenen, hem de confluent fibroblast büyümesi ile sonuçlanan. E ve F 'deki hücreler doku kültüründe plastikten işlenmiş. RT 'de 5 dakika trypsinizing sonra, fibroblastlar aspirasyon ile kaldırıldı; Ancak, kalan epitelyal hücreler yerine üç boyutlu organoidler (G) Tek tabakalı kültürü oluşturdu. A-G için ölçek çubukları 100 μm temsil eder. (H) farklı kolajenaz türleri (ı (CI) ve VIII (cvııı)) ve hücre işleme yöntemleri (filtrasyon ve santrifüj farklılaşma (cent diff)) test edildi ve meme bezi başına nevuslardır verim nicelik (n = 2 CVııı için bezler, filtre; 2 bezi, filtre; CI, cent diff için 4 bezleri ve CVııı, cent diff için 12 bezleri). İstatistiksel önem iki kuyruklu, eşleştirilmemiş t-testi, * * * p < 0.0001 kullanılarak belirlendi. Hata çubukları standart hatayı temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3. Temsilci organoid büyüme. Düşük yapışma plaklarda ışınlanmış nevuslardır büyüme faz kontrast görüntüleri elde 20 (A), 44 (B), ve 106 (C) tohumlama sonra saat. Beyaz ok uçları, kanallar ve loblara benzer morfolojiye sahip yapıları gösterir. Faz kontrast görüntüleri Bodrum membranında radyasyonlu nevuslardır büyüme elde 42 (D), 66 (E), 60 (F), ve 114 (G) saat tohumlama sonra. Ölçek çubukları 50 μm. H temsil eder . Farklı büyüme koşullarında alan ölçümleri elde edildi: hemen sindirim ve sıralama (ışınlanmış (●), kontrol (▪)) ve organoidler (radyasyon (○), kontrol (□)) (n = 3 bezleri). Alan hesaplamaları ımagej yazılımı kullanılarak yapılmıştır. Hata çubukları standart hatayı temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4. Radyasyonlu Organoidlerde epitelyal Marker Ifadesi. Sitamidat 14 (K14, yeşil), Skuam ve skuayöz olmayan epitellerin bazal tabakası için bir marker, ışınlanmış organoidler (a) üzerine ifade edildi. Yapışma için gerekli olan bir protein olan e-cadherin (E-CAD), radyasyonlu organoidlerde (B) hücreler arasındaki kavşak içinde ifade edildi. Sıkı kavşak protein bir (ZO-1) de ışınlanmış organoidler (C) hücre kavşağında ifade edildi. Görüntüler, Konfokal mikroskobik aracılığıyla Oda slaytlarında elde edilmiştir. Nükleik asit lekesi çekirdekleri görselleştirmek için kullanılmıştır (mavi). Tüm organoids büyüme bir hafta sonra sabit ve görüntülenmiştir. Ölçek çubukları 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 5. Organoidlerde F-actin ifadesi. Epitel hücrelerinde mikrofilament olan F-actin (kırmızı), radyasyon olmayan organoidlerde (a, C, E) radyasyona göre daha düşük yoğunlukta (B, D, F) organoidlerle ifade edildi. Nükleik asit lekesi çekirdekleri görselleştirmek için kullanılmıştır (mavi). Görüntüler düşük yapışma 96-kuyu plakaları (A, B) ve 16-kuyu odası kaydırakları (C, D) alınmıştır. Görüntüleri de Konfokal mikroskobik (E, F) kullanılarak alınmıştır. Tüm organoids büyüme bir hafta sonra sabit ve görüntülenmiştir. Ölçek çubukları 50 μm. G 'dir. Düşük yapışma plakası görüntülerinden phalloidin floresans verileri ımagej 'de (n = 3 bez) ölçülebilir. Hata çubukları standart hatayı gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6. Makrophaj-organoid Co-Culture ile hücre-hücre etkileşimlerini değerlendirmek. Makrofajlar (kırmızı) sızan kontrol (A) ve ışınlanmış (B) organoidler. Ölçek çubukları 50 μm temsil eder. Görüntü alanında (C) makrofajların ortalama yüzde alanı, kontrol (sarı) ve ışınlanmış (turuncu) organoidler için 24 saatlik ortak kültürde (her örnek için n = 3 bez) bildirilmiştir. Macrofajlar 10.000 hücre/mL, 50.000 hücreler/mL ve 100.000 hücreler/mL konsantrasyonları ile tohumlandı ve onların infiltrasyonu canlı hücre floresans görüntüleme yoluyla her 30 dakikada bir yakalandı. Tüm ortak kültür denemeleri ilk nevuslardır tohumlama işleminden 7 gün sonra başlamıştır. İstatistiksel önem iki kuyruklu, eşleştirilmemiş t-testi, * p < 0.05, * * * p < 0.0001 kullanılarak belirlendi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, ışınlanmış meme organoidlerin tekrarlanabilir büyümesi ve karakterize edilmesi için bir yöntem geliştirdik (Şekil 1). Tümör hücresi işe alma5' in vivo modellerinin önceki yansımaları Için 20 GY ışınlama dozu uygulandı. Meme bezlerinin ışınlanması ex vivo önce nevuslardır oluşumu bağışıklık hücrelerinin karşılık gelen infiltrasyon olmadan radyasyon hasar etkileri yalıtım için izin. Bir in vitro ışınlanmış normal doku modeli gelişimi radyasyon indüklenen CTC işe katkıda bulunabilir hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı görüntüleme sağlar11,12.
1.5-1.18 adımlarının yakından takip edilmesi nevuslardır verimi maksimize etmek için kritik öneme sahipti. Biz sindirim çözeltisi konsantre kolajenaz çözülmüş plakaya ekledik. Konsantre kolajenaz aliquot son derece viskoz doğası nedeniyle, miktar ve bu nedenle enzimatik aktivite bazı varyasyonlar olabilir, bu nedenle nevuslardır sindirim yakından aşırı sindirim önlemek için izlenmelidir. Bu sindirim için bile bir yüzey alanı sağlar gibi bir 50 mL tüp organoids sindirmek için de önemlidir. Diğer çalışmalar arıtıcı organoidler için filtrasyon kullandı19,23; Ancak, santrifüjlü farklılaşma ile çok daha yüksek verim arıtılması elde ettik (Şekil 2H). Ön kaplama Pipetler, pipet uçları ve BSA çözeltisi ile santrifüjler, verimi en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Çözüm uygulaması ihmal edildiğinde organoids kaplamasız plastiğe dikkat çekecek şekilde uyması.
Büyük bakım duman çekiş organoids önlemek için alınmalıdır. Bu, arındırıcı, ortam değiştirme ve floresan işaretçileri için boyama sırasında oluşan bir risktir. Büyüme için düşük yapışma plakaları kullanarak organoidler kolay transfer sağlar ve organoids için ihtiyaç kaldırır daha fazla boyama için EKIM ayında kesilebilir, Bodrum membran gömülü organoids11için gerekli bir prosedür. Üstün büyüme faydaları ek olarak, düşük yapışma plakaları içinde radyasyon ışınlanmış organoidler daha az adım gerekli ve daha az teknik Bodrum membran veya kollajen organoids tarım daha zordur. Ancak, işaretçileri için boyama zaman, yanlışlıkla aspirasyon oluşmaz sağlamak için bir mikroskop altında organoids görüntülemek için yararlı olabilir.
Dahası, görüntüleme organoidleri için hesaba katılması gereken birçok noktalar vardır. Bodrum membran gömülü organoidler içinde, zaman zaman fibroblast büyüme görülebilir (Şekil 2C, D). 3D kültürlü organoidlerde fibroblast gelişimi, yapışkanlık hücrelerdeki büyüyen fibroblast büyüme faktörü üretimine yol açtığı için doku kültürünü tedavi edilen yüzeye temas ederek organoidlerin neden olabilir27. İlginç bir şekilde, bu fibroblastların morfolojisi, her iki hücre türü de spindly, uzamış şekiller28olarak önceden adipanositlere çarpıcı bir şekilde benzer. Daha fazla soruşturma, insülin maruz kalma, dexametazon, ve 3-isobutyl-1-metilxanthine (ıbmx) Adipojenik bir soy ile hücreler verebilir, adipositler ile ilişkili daha küresel hücresel şekle doğru bir vardiya spurring28, 29. biz serbest büyüyen düşük yapışma (Şekil 3A-C) ve Bodrum membran gömülü faz kontrast mikroskopisi kullanarak net görüntüler elde (şekil 3D-G) organoids. Düşük yapışkanlık plaklarda bireysel nevuslardır büyümenin izlenmesi, hücreler ve kuyu yüzeyi arasındaki minimal fokal yapışmalara bağlı olarak, nevuslardır hareket ve ara sıra aspirasyon sonucunda zordur.
Bir kez yüzey işaretçileri için lekelenmiş, Konfokal mikroskopide daha net Marker yerelleştirme (Şekil 5E, F) Widefield mikroskobu (Şekil 5A-D) daha. Floresans miktarından, phalloidin ifadesinde eğilimler, ışınlanmış organoidlerin kontrol ile göreli olarak artan F-aksinin ifade edildiğini göstermektedir (Şekil 5G). Benzer dozlarda30' da ışınlanmış dermal mikrovasküler endotel hücrelerinde actin siteral yeniden yapılanma gözlenmiştir.
Uzun görüntüleme dizileri için, bağışıklık hücreleri ile zaman atlamalı Co-Culture gibi (Şekil 6), nem ve Co2 kontrol ile canlı bir hücre görüntüleme odası gereklidir31. Her 30 dakikada bir çekilen canlı hücre görüntüleri, 24 saat sonra (Şekil 6a, B), tercihen radyasyonlu organoidlere doğru göç eden makrofajların organoidlerle ortak olarak lokalize olduğunu ortaya koydu (Şekil 6c). Radyasyonlu normal dokuya makrophaj infiltrasyonu gözlenen, kemokin ve sittoin degradeler atfedilen, ve genellikle CTC işe5öncesinde. Gelecekteki çalışmalar klasik olarak değerlendirilecektir ve alternatif olarak kutuplaşmış makrophaj dinamikleri radyasyon32,33yanıtı belirlemede önemli bir rol oynayabilir gibi organoids ile etkin makrophaj etkileşimleri. Ek analizler, bu değişkenler organoid-immün hücre etkileşimleri üzerinde önemli etkilere sahip olduklarından, serum açlık ve kültür organoidlerinin tam medyada büyüme etkilerinin sonuçlarını değerlendirecektir. Bu sistem diğer hücre tipleriyle birlikte, CD8 + T hücreleri, stromal hücreler, adilositler ve meme kanseri hücreleri de dahil olmak üzere Co-Culture için adapte edilebilir. Canlı hücre görüntüleme gibi tekniklerle gerçek zamanlı gözlem CTC işe katkı olan normal doku radyasyona katkıda potansiyel mekanizmaları aydınlatılmasında kolaylaştıracak, tekrarlayan muzdarip hastalar için önemli etkileri olabilir hangi Bir daha.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz GFP ve dTomato etiketli RAW 264,7 macrofajlar sağlamak için Dr Laura L. Bronsart teşekkür ederiz. Bu araştırma NıH Grant #R00CA201304 tarafından mali olarak destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
References
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H.
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
- Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S.
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
