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Biochemistry

Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden

Published: June 25, 2019
doi:
10.3791/59308
, , , ,
1Department of Sciences and Technologies (DST),University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group,Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions,University of Naples Federico II

Summary

Präsentiert sind hier Protokolle für die immunhistochemische Charakterisierung und Lokalisierung von Orexin-Peptid, Orexin-Rezeptoren, und Endocannabinoid-Rezeptoren im Darm und Gehirn von normalen und Diät-induzierten Adipositas (DIO) erwachsene Zebrafisch-Modelle mit Immunperixidase und Doppelimmunfluoreszenzmethoden.

Abstract

Immunhistochemie (IHC) ist eine hochsensible und spezifische Technik, die beim Nachweis von Zielantigenen in Gewebeabschnitten mit markierten Antikörpern beteiligt ist. Es ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem die Optimierung jedes Schritts entscheidend ist, um das optimale spezifische Signal zu erhalten. Durch IHC kann die Verbreitung und Lokalisierung spezifischer Biomarker nachgewiesen werden, die Informationen zur evolutionären Konservierung aufzeigen. Darüber hinaus ermöglicht IHC das Verständnis von Expression und Verteilung simonischen Veränderungen von Biomarkern unter pathologischen Bedingungen, wie Fettleibigkeit. IHC, hauptsächlich die Immunfluoreszenztechnik, kann bei erwachsenen Zebrafischen verwendet werden, um die Organisation und Verteilung von phylogenetisch konservierten Molekülen zu erkennen, aber ein Standard-IHC-Protokoll ist nicht veröffentlicht. Orexin und Endocannabinoid sind zwei hochkonservierte Systeme, die an der Kontrolle der Nahrungsaufnahme und Adipositaspathologie beteiligt sind. Berichtet werden hier Protokolle verwendet, um Informationen über Orexin Peptid (OXA), Orexin-Rezeptor (OX-2R) und Cannabinoid-Rezeptor (CB1R) Lokalisierung und Verteilung in den Darm und Gehirn von normalen und Diät-induzierten adipösen (DIO) erwachsenen Zebrafisch-Modelle zu erhalten. Ebenfalls beschrieben sind Methoden zur Immunperoxidase und doppelten Immunfluoreszenz sowie die Herstellung von Reagenzien, Fixierung, Paraffin-Einbettung und Kryoschutz von Zebrafischgewebe und Vorbereitung auf einen endogenen Aktivitätsblockierungsschritt und Hintergrund Gegenfärbung. Der vollständige Satz von Parametern wird aus früheren IHC-Experimenten gewonnen, durch die wir gezeigt haben, wie Immunfluoreszenz beim Verständnis von OXs, OX-2R und CB1R-Verteilung, Lokalisierung und Erhaltung der Expression in erwachsenen Zebrafischen helfen kann. Gewebe. Die resultierenden Bilder mit hochspezifischer Signalintensität führten zur Bestätigung, dass Zebrafische geeignete Tiermodelle für immunhistochemische Studien der Verteilung, Lokalisierung und evolutionären Konservierung spezifischer Biomarker in physiologischen und pathologischen Bedingungen. Die hier vorgestellten Protokolle werden für IHC-Experimente an erwachsenen Zebrafischen empfohlen.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) ist eine etablierte klassische Technik zur Identifizierung von Zell- oder Gewebekomponenten (Antigene) durch Antigen-Antikörper-Interaktion1,2. Es kann verwendet werden, um die Lokalisierung und Verteilung von Zielbiomolekülen innerhalb eines Gewebes zu identifizieren. IHC verwendet immunologische und chemische Reaktionen, um Antigene in Gewebeabschnitten3zu erkennen. Die wichtigsten Marker, die für die Visualisierung von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen verwendet werden, sind Fluoreszenzfarbstoffe (Immunfluoreszenz) und Enzym-Substrat-Farbreaktionen (Immunoperoxidase), die beide mit Antikörpern konjugiert sind4. Mittels mikroskopischer Beobachtung ist es möglich, die Lokalisation von markiertem Gewebe zu bestimmen, was in etwa der Lokalisation des Zielantigens im Gewebe entspricht.

Es gibt zwei Methoden für fluoreszierende oder chromogene Reaktionen zum Nachweis von Proteinen: die direkte Detektionsmethode, bei der der spezifische Primärantikörper direkt gekennzeichnet ist; und die indirekte Detektionsmethode, bei der der primäre Antikörper unkonjugiert wird, während der sekundäre Antikörper das Etikett5,6,7trägt. Die indirekte Methode hat einige Vorteile, die vor allem ihre Signalverstärkung ist. Darüber hinaus ist es im Gegensatz zu anderen molekularen und zellulären Techniken mit Immunfluoreszenz möglich, die Verteilung, Lokalisierung und Koexpression von zwei oder mehr Proteinen, die in Zellen und Geweben differenziell exprimiert werden, zu visualisieren7. Die Wahl der verwendeten Erkennungsmethode hängt von experimentellen Details ab.

Bis heute ist IHC in der Grundlagenforschung als ein leistungsfähiges und wesentliches Werkzeug zum Verständnis der Verteilung und Lokalisierung von Biomarkern und der allgemeinen Profilierung verschiedener Proteine im biologischen Gewebe vom Menschen bis zu den wirbellosen Tieren 8, 9 , 10 , 11. Die Technik hilft, eine Karte der Proteinexpression in einer großen Anzahl von normalen und veränderten tierischen Organen und verschiedenen Gewebetypen anzuzeigen, was eine mögliche Down- oder Up-Regulierung der Expression zeigt, die durch physiologische und pathologische Veränderungen induziert wird. IHC ist eine hochsensible Technik, die Genauigkeit und die richtige Wahl der Methoden erfordert, um optimale Ergebnisse zu erzielen12. Zuallererst können viele verschiedene Faktoren wie Fixierung, Kreuzreaktivität, Antigenabruf und Empfindlichkeit von Antikörpern zu falsch positiven und falsch negativen Signalen führen13. Die Auswahl der Antikörper ist einer der wichtigsten Schritte in IHC und hängt von der Antigenspezifität und ihrer Affinität zu dem untersuchten Protein und den untersuchten Artenab 7.

Kürzlich haben wir die IHC-Technik optimiert, um Mitglieder von Orexin/Hypocretin- und Endocannabinoidsystemen in erwachsenem Zebrafischgewebe zu erkennen. Wir haben uns hauptsächlich auf Fixierung, Gewebeeinbettung mit zwei verschiedenen Ansätzen konzentriert, Schnitt und Montage (die Auflösung und Detail während der mikroskopischen Analyse beeinflussen können), und Blockierung (um falsch positive Positivmeldungen zu verhindern und Hintergrund zu reduzieren)14. Weitere wichtige Merkmale sind die Antikörperspezifität und Selektivität und Reproduzierbarkeit einzelner IHC-Protokolle. Der Schlüssel zur Bereitstellung von Antikörperspezifität ist die Verwendung von Negativkontrollen (einschließlich aller primären Antikörper oder Gewebe, von denen bekannt ist, dass sie die Zielproteine nicht ausdrücken) sowie positiver Kontrollen (einschließlich Gewebe, das bekanntermaßen die Zielproteine ausdrückt)15 . Die Auswahl von Antikörpern für IHC erfolgt auf der Grundlage ihrer Artenspezifität (die Wahrscheinlichkeit, mit der sie mit dem Antigen von Interesse reagieren) und den Antigen-Antikörper-Bindungsdetektionssystemen, die verwendet werden4,5,6 ,7. Bei Der Immunperoxidase wird die Farbe der Reaktion durch die Auswahl des niederschlagsbestimmenden Chromogens, in der Regel Diaminobenzidin (braun)16bestimmt. Auf der anderen Seite nutzt immunofluoreszenz Antikörper, die mit einem Fluorophor konjugiert sind, um die Proteinexpression in gefrorenen Gewebeabschnitten zu visualisieren und ermöglicht eine einfache Analyse mehrerer Proteine in Bezug auf das chromogene Detektionssystem. 5 , 7.

In der Immunoperoxidase-Technik wird der sekundäre Antikörper mit Biotin konjugiert, einem Linkermolekül, das in der Lage ist, ein chromogenes Reportermolekül [Avidin-Biotin-Komplex (ABC)] zu rekrutieren, was zur Verstärkung des Färbesignals führt. Mit der ABC-Reportermethode reagiert das Enzym Peroxidase mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) und erzeugt eine intensiv braun gefärbte Färbung, bei der das Enzym an den Sekundärantikörper bindet, der dann mit einem gewöhnlichen Lichtmikroskop analysiert werden kann. ABC-Färbung, aufgrund der hohen Affinität von Avidin für Biotin, produziert eine schnelle und optimale Reaktion, mit wenigen sekundären Antikörpern an der Stelle der primären Antikörperreaktivität befestigt. Diese chromogene Detektionsmethode ermöglicht die densitometrische Analyse des Signals und liefert semiquantitative Daten, die auf der Korrelation brauner Signalniveaus mit den Proteinexpressionsstufen18basieren.

Mit Immunfluoreszenz-Techniken ist der gleichzeitige Nachweis mehrerer Proteine aufgrund der Fähigkeit verschiedener Fluorchrome möglich, Licht bei einzigartigen Wellenlängen auszusenden, ist jedoch wichtig, Fluorchrome sorgfältig zu wählen, um spektrale Überlappungen zu minimieren. 5. Darüber hinaus minimiert die Verwendung primärer Antikörper bei verschiedenen Wirtsarten Schwierigkeiten bei der Kreuzreaktivität. In diesem Fall erkennt jeder artspezifische sekundäre Antikörper nur einen Primärantikörpertyp. Fluoreszierende Reporter sind kleine organische Moleküle, einschließlich kommerzieller Derivate, wie Alexa FluorFarbstoffe.

Viele Tiermodelle werden verwendet, um bestimmte physiologische und pathologische Bedingungen zu verstehen. Bis heute ist fest, dass viele Stoffwechselwege im Laufe der Evolution konserviert werden. Daher können IHC-Studien an Modellorganismen wie Zebrafischen Einblicke in die Entstehung und Aufrechterhaltung pathologischer und nichtpathologischer Erkrankungen geben17. Ziel dieses Berichts ist es, IHC-Protokolle zu veranschaulichen, die auf erwachsenem Zebrafischgewebe durchgeführt werden können und verwendet werden, um detaillierte Bilder der Verteilung und Lokalisierung von OXA, OX-2R und CB1R auf peripherer und zentraler Ebene zu erhalten. Ebenfalls berichtet sind Protokolle für die Anwendung von zwei wichtigen iHC indirekten Methoden in peripheren und zentralen Geweben von erwachsenen Zebrafischen. Beschrieben wird die indirekte Methode, die eine Signalverstärkung in Fällen ermöglicht, in denen ein sekundärer Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Immunfluoreszenzmethode) oder Enzymreporter (Immunoperoxidase-Methode) konjugiert wird. Sowohl chromogene als auch fluoreszierende Detektionsmethoden haben Vor- und Nachteile. In diesem Protokoll wird berichtet, dass IHC, hauptsächlich Immunfluoreszenz, bei erwachsenen Zebrafischen verwendet wird, ein Tiermodell, das weit verbreitet ist, um Systeme zu untersuchen, die evolutionär unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen konserviert werden.

Protocol

1. Immunperoxidase-Protokoll HINWEIS: Die Zebrafische wurden von Prof. Omid Safari (Department of Fisheries, Faculty of Natural Resources and Environment, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran)10gewonnen. Gewebesektion Opfern Sie den Zebrafisch durch Eintauchen in Eiswasser (5 Teile Eis/1 Teil Wasser, 4 °C); lassen Sie sie bis zur Beendigung aller Bewegung, um den Tod durch Hypoxie zu gewährleisten. Entfernen Sie…

Representative Results

Repräsentative Daten für die Immunoperoxidase-Färbung sind in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt. Die immunhistochemische Analyse der OX-A- und OX-2R-Verteilung im Darm erwachsener Zebrafische zeigte verschiedene Lokalisationsstellen von OX-A und OX-2R und deren Expressioninitiierung in den Darmzellen von DIO-Zebrafischen. Eine intensive braune Färbung für OX-A wurde in den Zellen des medialen und vorderen Darms beobachtet (Abbildun…

Discussion

Probenvorbereitung

Die Probenvorbereitung ist der erste kritische Schritt im IHC. Ein zuverlässiges Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung der Zellmorphologie, Gewebearchitektur und Antigenität. Dieser Schritt erfordert die korrekte Gewebesammlung, Fixierung und Abschnitt22, 23. Der Zweck der Fixierung ist es, Gewebe zu erhalten und die Wirkung von Gewebeenzymen oder Mikroorganismen zu reduzieren. Insbeso…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, University of Sannio, unterstützt.

Materials

Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603
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Imperatore, R., D’Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).
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