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Biochemistry

免疫ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光法を用いて成体ゼブラフィッシュにおけるオレキシンおよびエンドカンナビノイド受容体の同定

Published: June 25, 2019
doi:
10.3791/59308
, , , ,
1Department of Sciences and Technologies (DST),University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group,Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions,University of Naples Federico II

Summary

ここでは、オレキシンペプチド、オレキシン受容体、および正常および食事誘発肥満(DIO)成人ゼブラフィッシュモデルの腸および脳における内因性カンナビノイド受容体の免疫組織化学的特徴付けおよび局在化のためのプロトコルを示す。免疫ペリキシダーゼおよび二重免疫蛍光法。

Abstract

免疫組織化学(IHC)は、標識抗体を持つ組織切片における標的抗原の検出に関与する高感度かつ特異的な技術である。これは、最適な特定の信号を得るために各ステップの最適化が重要であるマルチステッププロセスです。IHCを通じて、特定のバイオマーカーの分布と局在化を検出し、進化的保全に関する情報を明らかにすることができます。さらに、IHCは肥満などの病理学的状態におけるバイオマーカーの発現および分布変化を理解することを可能にする。IHCは、主に免疫蛍光技術を用いて、成体ゼブラフィッシュで系統的に保存された分子の組織と分布を検出するために使用できますが、標準的なIHCプロトコルは絶え間ない。オレキシンとエンドカンナビノイドは、食物摂取と肥満病理の制御に関与する2つの高度に保存されたシステムです。ここで報告されるプロトコルは、オレキシンペプチド(OXA)、オレキシン受容体(OX-2R)、およびカンナビノイド受容体(CB1R)の正常および食事誘発肥満(DIO)成人ゼブラフィッシュモデルの腸および脳における局在および分布に関する情報を得るために使用されるプロトコルである。また、免疫ペルオキシダーゼおよび二重免疫蛍光、試薬の調製、固定、パラフィン埋め込み、ゼブラフィッシュ組織の凍結保護および内因性活性遮断工程および背景の調製方法についても説明する。カウンターステイン。パラメータの完全なセットは、以前のIHC実験から得られ、免疫蛍光が成人ゼブラフィッシュにおけるOX、OX-2R、CB1R分布、局在化、発現の保全の理解にどのように役立するかを示しました。組織。得られた画像は、非常に特異的なシグナル強度を有する画像で、ゼブラフィッシュが特定バイオマーカーの分布、局在化、進化的保存の免疫組織化学的研究に適した動物モデルであることを確認した。生理学的および病理学的状態。ここで提示されるプロトコルは、成ゼブラフィッシュにおけるIHC実験に推奨されます。

Introduction

免疫組織化学(IHC)は、抗原抗体相互作用1、2によって細胞または組織成分(抗原)を同定するために使用される確立された古典的な技術である。組織内の標的生体分子の局在化および分布を同定するために使用することができる。IHCは、組織セクション3の抗原を検出するために免疫学的および化学的反応を使用しています。抗原抗体相互作用の可視化に使用される主なマーカーには、蛍光色素(免疫蛍光)および酵素基質色反応(免疫ペルオキシダーゼ)が含まれ、いずれも抗体4に共役する。顕微鏡観察を用いて、組織内の標的抗原の局在化にほぼ対応する標識組織の局在を決定することができる。

タンパク質を検出するための蛍光または発色反応には、特定の一次抗体が直接標識される直接検出方法の2つの方法があります。二次抗体が標識5、6、7を運ぶ間、一次抗体が結合されない間接検出方法。間接法には、主に信号増幅であるいくつかの利点があります。また、他の分子および細胞技術とは異なり、免疫蛍光を伴い、細胞および組織7内で分化して発現する2つ以上のタンパク質の分布、局在、および共発現を可視化することができる。使用される検出方法の選択は、実験の詳細に依存します。

現在までに、IHCは、バイオマーカーの分布と局在化を理解し、ヒトから無脊椎動物への生体組織における異なるタンパク質の一般的なプロファイリングを理解するための強力かつ不可欠なツールとして、基礎研究に広く使用されています8、9,10歳,11.この技術は、多数の正常および変化した動物器官および異なる組織型におけるタンパク質発現の地図を表示するのに役立ち、生理学的および病理学的変化によって誘発される発現のダウンまたはアップレギュレーションの可能性を示す。IHCは、最適な結果を得るために正確さと方法の正しい選択を必要とする高感度技術です 12.まず第一に、固定、交差反応性、抗原検索、および抗体の感受性などの多くの異なる因子は、偽陽性および偽陰性シグナル13を引き起こす可能性がある。抗体の選択は、IHCにおける最も重要なステップの1つであり、抗原特異性および調査中のタンパク質および種との親和性に依存する7.

最近では、成体ゼブラフィッシュ組織のオレキシン/ヒポクレチンおよびエンドカンナビノイド系のメンバーを検出するためにIHC技術を最適化しました。我々は主に固定、2つの異なるアプローチを使用して組織埋め込み、断面および取り付け(顕微鏡分析中の解像度および詳細に影響を与える可能性がある)、およびブロッキング(偽陽性を防止し、背景を減らすために)14に焦点を当てている。他の重要な特徴は、個々のIHCプロトコルの抗体特異性および選択性および再現性である。抗体特異性を提供する鍵は、負のコントロール(標的タンパク質を発現しないことが知られている一次抗体または組織を含まない)と陽性コントロール(標的タンパク質を発現することが知られている組織を含む)の使用である15.IHCのための抗体の選択は、その種特異性(それらが目的の抗原と反応する可能性)および4、5、6を使用される抗原抗体結合検出システムに基づいて行われる。 、7.免疫ペルオキシダーゼの場合、反応の色は沈殿染色体の選択によって決定され、通常ジアミノベンジジン(褐色)16。一方、i mmuno蛍光は、蛍光結合抗体を利用して凍結組織切片におけるタンパク質発現を可視化し、発色検出システムに関して複数のタンパク質を容易に解析することができます。5,7.

免疫ペルオキシダーゼ技術では、二次抗体をビオチンに結合させ、発色レポーター分子[アビジンビオチン複合体(ABC)]をリクルートすることができるリンカー分子であり、染色シグナルの増幅につながる。ABCレポーター法では、酵素ペルオキシダーゼが3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)と反応し、酵素が二次抗体に結合する強烈な茶色の染色を生み出し、通常の光顕微鏡で分析することができます。ABC染色は、ビオチンに対するアビジンの親和性が高いため、一次抗体反応性の部位に付着した二次抗体がほとんどなく、迅速かつ最適な反応を生み出す。この発色検出方法は、シグナルの密度分析を可能にし、タンパク質発現レベル18との褐色シグナルレベルの相関に基づく半定量的データを提供する。

免疫蛍光技術では、異なるフルオロクロムが独特の波長で発光する能力により、複数のタンパク質の同時検出が可能ですが、スペクトルの重複を最小限に抑えるために、蛍光色素を慎重に選択することが重要です。5.さらに、異なる宿主種における一次抗体の使用は、交差反応性に関する困難を最小限に抑える。この場合、種特異的二次抗体は1種類の一次抗体のみを認識する。蛍光レポーターは、Alexa Fluor染料などの市販の誘導体を含む小さな有機分子です。

多くの動物モデルは、特定の生理学的および病理学的状態を理解するために使用される。今日まで、多くの代謝経路が進化の過程で保存されていることが確立されています。したがって、ゼブラフィッシュなどのモデル生物におけるIHC研究は、病理学的および非病理学的状態の起源および維持に関する洞察を提供することができる17.この報告書は、成虫ゼブラフィッシュ組織に対して行うことができ、周辺および中央レベルでのOXA、OX-2R、およびCB1Rの分布および局在化の詳細な画像を得るために使用されるIHCプロトコルを示すことを目的とする。また、成ゼブラフィッシュの末梢および中央組織における2つの主要なIHC間接法の適用のためのプロトコルも報告されている。記載されている間接法は、二次抗体が蛍光色素(免疫蛍光法)または酵素レポーター(免疫ペルオキシダーゼ法)に結合した場合のシグナル増幅を可能にする。発色性および蛍光検出方法の両方に長所と短所があります。このプロトコルで報告されているのは、IHCの使用、主に免疫蛍光、成体ゼブラフィッシュにおいて、異なる生理学的および病理学的条件にわたって進化的に保存されるシステムを研究するために広く使用される動物モデルである。

Protocol

1. 免疫ペルオキシダーゼプロトコル 注:ゼブラフィッシュは、オミッド・サファリ教授(水産学部、マシュハド大学、マシュハド、イラン)10によって得られました。 組織解剖 氷水(5部氷/1部水、4°C)に浸漬してゼブラフィッシュを犠牲にする。低酸素症による死を確実にするために、すべての運動の停止までそれらを残します。…

Representative Results

免疫ペルオキシダーゼ染色の代表的なデータを図1および図2に示す。成体ゼブラフィッシュの腸内におけるOX-AおよびOX-2R分布の免疫組織化学的分析は、OX-AおよびOX-2Rの異なる局在部位およびDIOゼブラフィッシュの腸細胞における発現の増加を示した。前腸および前腸の細胞においてOX-Aに対する強烈な褐色染色が認められた(図1A,A1)。<strong cl…

Discussion

サンプル調製

サンプル調製は、IHCの最初の重要なステップです。信頼性の高いプロトコルは、細胞形態、組織構造、および抗原性の維持を可能にします。このステップでは、正しい組織収集、固定、および断面22、23が必要です。固定の目的は、組織を保存し、組織酵素や微生物の作用を減らすことです。特?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、サンニオ大学フォンディ・リサーカ・ディ・アテネオ(FRA)2015-2016によって支援されました。

Materials

Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603
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