JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Immunoperoksidan ve Immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin Zebrafisinde Orexin ve Endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması

Published: June 25, 2019
doi:
10.3791/59308
, , , ,
1Department of Sciences and Technologies (DST),University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group,Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions,University of Naples Federico II

Summary

Burada sunulan immunhistokimyasal karakterizasyon ve oreksin peptid lokalizasyonu için protokoller, oreksin reseptörleri, ve bağırsak ve normal ve diyet kaynaklı obezitenin beyni endokannabinoid reseptörleri (IO) Yetişkin zebra balığı modelleri kullanarak immunoperixidaz ve çift immünofluorescence yöntemleri.

Abstract

İmmunohistokimya (ıHC), etiketli antikorlar içeren doku bölümlerinde hedef antijenlerin saptanması ile ilgili son derece hassas ve spesifik bir tekniktir. Bu, her adımın optimizasyonunun optimum spesifik sinyali elde etmek için çok önemli olduğu çok adımlı bir süreçtir. IHC aracılığıyla, belirli biyomarkerlerin dağıtımı ve lokalizasyonu, evrimsel koruma hakkında bilgi açığa çıkarılabilir. Dahası, ıHC, obezite gibi patolojik koşullarda biyomarkerlerin ifade ve dağıtım değişikliklerinin anlaşılması için izin verir. IFC, ağırlıklı olarak immünofluorescence tekniği, Yetişkin zebra balığı ‘de, fizik olarak kullanılan moleküllerin organizasyonunu ve dağıtımını algılamak için kullanılabilir, ancak standart bir IFC Protokolü estasblished değildir. Orexin ve Endokanabinoid, gıda alımı ve obezite patolojisinin kontrolünde yer alan iki yüksek oranda tüketmeli sistemlerdir. Burada bildirilen protokolleri oreksin peptid (Oxa), oreksin reseptör (Ox-2R) ve kanabinoid reseptör (CB1R) lokalizasyonu ve bağırsak ve beyin normal ve diyet kaynaklı obez (dıo) Yetişkin zebra balığı modellerinin içinde dağıtım hakkında bilgi almak için kullanılır. Ayrıca, immünoperoksidaz ve çift immünofluorescence için yöntemler, reaktifler, fiktasyon, parafin-katıştırma ve zebra balığı dokusunun cryoprotection hazırlanması ve endojen aktivite engelleme adım ve arka plan için hazırlama yöntemleri vardır karşı boyama. Parametrelerin tam kümesi önceki IHC deneylerinden elde edilir, hangi aracılığıyla biz immünofluorescence Oxs, Ox-2R ve CB1R dağılımı, yerelleştirme ve yetişkin zebra balığı ifade korunması anlayışı ile yardımcı olabilir göstermiştir Doku. Yüksek spesifik sinyal yoğunluğu ile ortaya çıkan görüntüler zebra balığı dağıtım, lokalizasyon ve spesifik biyokütörler evrimsel koruma, immünhistokimyasal çalışmalar için uygun hayvan modelleri olduğunu teyit yol açtı fizyolojik ve patolojik koşullar. Burada sunulan protokoller yetişkin zebrafish ıFC deneyler için tavsiye edilir.

Introduction

İmmünhistokimya (IHC), antijen-antikor etkileşimi1,2ile hücresel veya doku bileşenlerini (antigens) tanımlamak için kullanılan iyi kurulmuş bir klasik tekniktir. Bir doku içinde hedef biyomoleküllerin lokalizasyonu ve dağılımı tanımlamak için kullanılabilir. IHC doku bölümlerindeki antijenleri algılamak için immünolojik ve kimyasal reaksiyonlar kullanır3. Antijen-antikor etkileşimlerinin görselleştirme için kullanılan ana belirteçleri floresan boyalar (immünofluorescence) ve enzim-substrat renk reaksiyonları (immünoperoksidan), hem antikorlar4konjuate. Mikroskobik gözlem kullanarak etiket doku lokalizasyonu belirlemek mümkündür, hangi yaklaşık doku hedef antijen lokalizasyonu karşılık gelir.

Floresan veya kromojenik reaksiyonlar için protein algılamak için iki yöntem var: belirli birincil antikor doğrudan etiketli olduğu doğrudan algılama yöntemi; ve ikincil antikor etiket5,6,7taşır ederken primer antikor unconjuated olduğu dolaylı algılama yöntemi. Dolaylı Yöntem, çoğunlukla sinyal amplifikasyonu olan bazı avantajlara sahiptir. Dahası, diğer moleküler ve hücresel tekniklerin aksine, immünofluoresesans ile, hücreler ve dokular içinde ayırt edilen iki veya daha fazla proteinin dağılımı, lokalizasyonu ve koifadesini görselleştirmek mümkündür7. Kullanılan algılama yönteminin seçimi deneysel ayrıntılarına bağlıdır.

Bugüne kadar, ıHC yaygın olarak temel araştırmalarda biyomarkerlerin dağıtımını ve lokalizasyonunu ve insan biyolojik dokuda farklı proteinlerin genel profillerini omurgasızlar8‘ e kadar anlamak için güçlü ve temel bir araç olarak kullanılmaktadır. 9 , 10 ‘ dan fazla , 11. Teknik, normal ve değiştirilmiş hayvan organlarının ve farklı doku türlerinin çok sayıda protein ifadesinin bir haritasını görüntülemenize yardımcı olur ve fizyolojik ve patolojik değişikliklerle indüklenen ifadenin olası aşağı veya yukarı düzenlemesini gösterir. IHC en iyi sonuçları elde etmek için doğruluk ve doğru Yöntem seçimi gerektiren son derece hassas bir tekniktir12. Her şeyden önce, fiktasyon, çapraz reaktivite, antijen alımı ve antikorların duyarlılığı gibi birçok farklı faktör yanlış pozitif ve yanlış negatif sinyallere yol açabilir13. Antikor seçimi, ıHC ‘deki en önemli adımlardan biridir ve antijen özgüllüğü ve soruşturma altında protein ve türe olan benzeşimine bağlıdır7.

Son zamanlarda, Yetişkin zebra balığı dokusunda orexin/ikiyüzretin ve endokannabinoid sistemlerinin üyelerini algılamak için ihc tekniği optimize edilmiştir. Biz temel olarak sabitleme, doku katıştırma iki farklı yaklaşımlar, bölümlenme ve montaj (hangi çözünürlüğü ve ayrıntı mikroskobik analiz sırasında etkileyebilir), ve engelleme (yanlış pozitireleri önlemek ve arka plan azaltmak için)14odaklı. Diğer önemli özellikler, bireysel ıHC protokollerinin antikor özgüllüğü ve seçicilik ve yeniden üretilebilirliği. Antikor özgüllüğü sağlamak için anahtar negatif kontroller (hiçbir primer antikorlar veya hedef proteinleri ifade değil bilinen doku dahil) kullanımı yanı sıra pozitif kontroller (hedef proteinleri ifade bilinen doku dahil)15 . IHC için antikorların seçimi kendi türlerine göre yapılır-özgüllük (onlar faiz antijeni ile reaksiyon olasılığı) ve kullanılan antijen-antikor bağlama algılama sistemleri4,5,6 ,7. İmmünoperoksidaz durumunda, reaksiyon rengi, genellikle diaminobenzidin (kahverengi)16, çökelme Kromojen seçimi ile belirlenir. Öte yandan, benmmunofluorescence, dondurulmuş doku bölümlerinde protein ifadesini görselleştiren ve kromojenik algılama sistemine göre çoklu proteinlerin kolay analizine olanak sağlayan bir fluorophor ile konjuke edilen antikorları kullanır 5 , 7‘ ye kadar.

İmmünoperoksidaz tekniği, ikincil antikor biotin, bir bağlayıcı molekül bir kromojenik muhabir molekül [avidin-biotin kompleksi (ABC)], boyama sinyalinin amplifikasyon lider işe yeteneğine konjugated olduğunu. ABC Reporter yöntemi ile, enzim peroksidaz, 3, 3 ‘-diaminobenzidin (DAB) ile tepki verir, enzim ikincil antikor bağlayan bir yoğun kahverengi renkli boyama üreten, daha sonra sıradan bir ışık mikroskobu ile analiz edilebilir. ABC boyama, biotin için avidin yüksek yakınlık nedeniyle, hızlı ve optimum reaksiyon üretir, primer antikor reaktivite siteye bağlı birkaç ikincil antikorlar ile. Bu kromojenik algılama yöntemi, sinyalin densitometrik analizini sağlar ve kahverengi sinyal düzeylerinin protein ifade seviyeleri18ile korelasyon temelinde yarı nicel veriler sunar.

İmmünofluoresesans teknikleri ile, farklı fluorokrotların benzersiz dalga boylarında ışık yayması yeteneği nedeniyle çoklu proteinlerin eşzamanlı olarak algılanması mümkündür, ancak spektral çakışmayı en aza indirmek için florokromlarla ‘i dikkatle seçmek önemlidir 5. dahası, farklı ev sahibi türlerin primer antikorların kullanımı çapraz reaktivite ile ilgili zorlukları en aza indirir. Bu durumda, her türe özgü ikincil antikor primer antikor yalnızca bir tür tanır. Floresan gazeteciler, Alexa Fluor boyalar gibi ticari türevleri de dahil olmak üzere küçük organik moleküllerdir.

Birçok hayvan modelleri özellikle fizyolojik ve patolojik koşulları anlamak için kullanılır. Bugüne kadar, evrim boyunca birçok metabolik yol tarafından temin edilir. Bu nedenle, zebra balığı gibi model organizmalarda IHC çalışmaları, patolojik ve patolojik olmayan koşulların Yaratılış ve bakımı hakkında bilgi verebilir17. Bu raporun bir amacı, Yetişkin zebra balığı doku üzerinde gerçekleştirilebilecek IHC protokolleri göstermek ve dağılım ve lokalizasyonu Oxa, Ox-2R ve CB1R ayrıntılı görüntüleri elde etmek için kullanılan periferik ve merkezi düzeylerde. Ayrıca, Yetişkin zebrafish periferik ve merkezi dokularda iki büyük ıHC dolaylı yöntemlerin uygulanması için protokoller olduğunu bildirdi. Açıklanan dolaylı Yöntem, hangi ikincil bir antikor floresan boya (immünofluorescence yöntemi) veya enzim muhabiri (immünoperoksidan yöntemi) konjuli durumlarda sinyal amplifikasyon için izin verir. Hem kromojenik ve floresan algılama yöntemleri avantajları ve dezavantajları sahip. Bu protokolde bildirilen ıHC kullanımı, özellikle immünofluorescence, Yetişkin zebrafish, yaygın olarak farklı fizyolojik ve patolojik koşullar arasında gelişen evrimsel sistemleri incelemek için kullanılan bir hayvan modeli.

Protocol

1. immünoperoksidaz Protokolü Not: zebra balığı tarafından elde edildi Prof. Omid Safari (balıkçılık bölümü, doğal kaynaklar ve Çevre Fakültesi, Ferdowsi meşhad Üniversitesi, meşhad, Iran)10. Doku diseksiyonu Buz suyunda (5 parça buz/1 parça su, 4 °C) dalgıç ile zebrafi feda etmek; hipoksi tarafından ölüm sağlamak için tüm hareketin durdurulması kadar onları bırakın. Hızlı bir şekilde a…

Representative Results

İmmünoperoksidaz boyama için temsili veriler Şekil 1 ve Şekil 2′ de gösterilir. Yetişkin zebra balığı bağırsaklarında Ox-a ve Ox-2R dağılımı immunohistokimyasal Analizi Ox-a ve Ox-2R farklı yerelleştirme siteleri ve DIO zebra balığı bağırsak hücrelerinde ifade artışlar gösterdi. Medial ve anterior bağırsak hücrelerinde OX-A için yoğun bir kahverengi boyama görüldü (Şekil 1a, A1). OX-A …

Discussion

Numune hazırlama

Örnek hazırlama, ıHC ‘deki ilk kritik adımdır. Güvenilir bir protokol hücre morfoloji, doku mimarisi ve antigenicity bakımı için izin verir. Bu adım, doğru doku toplama, sabitleme ve bölüm22,23gerektirir. Sabitleme amacı doku korumak ve doku enzimleri veya mikroorganizmaların eylem azaltmak etmektir. Özellikle, sabitleme adım hücresel bileşenleri ve biomolecules korur, otoli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmada Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, Sannio Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

Materials

Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry–the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J., Howard, G. C., Kaser, M. R. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O’Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

ImmunohistochemistryImmunoperoxidaseImmunofluorescenceZebrafishOrexinEndocannabinoid ReceptorsCryosectioningBlockingPrimary AntibodiesIncubation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Imperatore, R., D’Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image