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Biochemistry

면역페록시다아제 및 면역형광방법을 이용한 성인용 제브라피시의 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 수용체 식별

Published: June 25, 2019
doi:
10.3791/59308
, , , ,
1Department of Sciences and Technologies (DST),University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group,Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions,University of Naples Federico II

Summary

여기에 제시된 면역성 화학적 특성화 및 오렉스신 펩티드, 오렉스신 수용체, 및 정상 및 식이 유발 비만(DIO) 성인 제브라피시 모델의 장내 엔도칸나비노이드 수용체의 국소화를 위한 프로토콜이 제시되어 있다. 면역 페릭시다아제 및 이중 면역 형광 방법.

Abstract

면역 조직 화학 (IHC)는 표지된 항체를 가진 조직 단면도에 있는 표적 항원의 검출에서 관련시키는 높게 과민하고 특정 기술입니다. 최적의 특정 신호를 얻기 위해 각 단계의 최적화가 중요한 다단계 프로세스입니다. IHC를 통해 특정 바이오마커의 분포와 국소화를 감지하여 진화적 보존에 대한 정보를 공개할 수 있습니다. 더욱이, IHC는 비만과 같은 병리학적인 조건에서 바이오마커의 발현 및 분포 변화의 이해를 가능하게 한다. IHC, 주로 면역 형광 기술, 계통 유전학적으로 보존 된 분자의 조직 및 분포를 검출하기 위해 성인 얼룩말에서 사용할 수 있지만, 표준 IHC 프로토콜은 estasbled되지 않습니다. 오렉스신과 엔도칸나비노이드는 음식 섭취와 비만 병리의 통제에 관여하는 두 개의 고도로 보존된 시스템입니다. 여기에 보고된 프로토콜은 오덱신 펩티드(OXA), 오렉스신 수용체(OX-2R), 카나비노이드 수용체(CB1R) 국소화 및 정상 및 식이 유발 비만(DIO) 성인 제브라피시 모델의 장및 뇌분포에 대한 정보를 얻기 위해 사용된다. 또한 면역페록시다아제 및 이중 면역형광에 대한 방법뿐만 아니라 시약의 제제, 고정, 파라핀-임베딩, 제브라피시 조직의 극저온 보호 및 내인성 활성 차단 단계 및 배경을 위한 제제 역염색. 매개 변수의 전체 세트는 우리가 면역 형광이 OXs, OX-2R 및 CB1R 분포, 현지화 및 성인 얼룩말에서 표현의 보존의 이해에 도움이 될 수있는 방법을 보여 준 이전 IHC 실험에서 얻은 조직. 고도로 구체적인 신호 강도를 가진 결과 이미지는 제브라피쉬가 특정 바이오마커의 분포, 국소화 및 진화적 보존에 적합한 동물 모델이라는 것을 확인했습니다. 생리적 및 병리학적 조건. 여기에 제시된 프로토콜은 성인 얼룩말어의 IHC 실험에 권장됩니다.

Introduction

면역조직화학(IHC)은 항원-항체 상호작용1,2에의해 세포 또는 조직 성분(antigens)을 식별하는 데 사용되는 잘 확립된 고전 기술이다. 조직 내의 표적 생체분자의 국소화 및 분포를 식별하는데 사용될 수 있다. IHC는 조직 섹션에서 항원을 검출하기 위해 면역 학적 및 화학 반응을 사용3. 항원-항체 상호작용의 가시화에 사용되는 주요 마커는 형광 염료(immuno형광) 및 효소 기질 색 반응(면역페록시다아제)을 포함하며,둘 다 항체에 공액화된다 4. 현미경 관찰을 사용하여 표지 된 조직의 국소화를 결정할 수 있으며, 이는 조직 내의 표적 항원의 국소화에 약 대응합니다.

단백질을 검출하기 위해 형광 또는 발색 반응을 위해 존재하는 두 가지 방법이 있습니다 : 특정 1 차 항체가 직접 표지되는 직접 검출 방법; 및 간접 검출 방법은, 1차 항체가 비공화되고 이차 항체가 라벨5,6,7을운반하는 동안. 간접 방법은 주로 신호 증폭이다 몇 가지 장점을 갖는다. 더욱이, 다른 분자 및 세포 기술과 달리, 면역형광과 함께, 세포 및 조직 내에서 분화되는 2개 이상의 단백질의 분포, 국소화 및 공동발현을 가시화할 수있다7. 사용되는 검출 방법의 선택은 실험 세부 사항에 따라 달라집니다.

현재까지 IHC는 인간에서 무척추 동물까지 생물학적 조직에서 다양한 단백질의 분포 및 국소화및 일반적인 프로파일링을 이해하는 강력하고 필수적인 도구로 서 기초 연구에 널리 사용되고있다 8, 9개 , 10개 , 11. 이 기술은 많은 수의 정상 및 변경 된 동물 장기 및 다른 조직 유형에서 단백질 발현지도를 표시하여 생리적 및 병리학적 변화에 의해 유도 된 발현의 하향 또는 업 조절을 보여줍니다. IHC는 최적의 결과를 얻기 위해 정확성과 올바른 방법을 필요로 하는 매우 민감한 기술입니다12. 우선, 고정, 교차 반응성, 항원 검색 및 항체의 민감도와 같은 많은 상이한 인자는 거짓양성 및 거짓 음성 신호(13)로 이어질 수 있다. 항체의 선택은 IHC에서 가장 중요한 단계 중 하나이며 조사 중인 단백질 및 종에 대한 항원특이성 및 그 친화성에 의존한다 7.

최근, 우리는 성인 얼룩말 조직에서 오렌신 / 저크레틴 과 엔도 칸 나비 노이드 시스템의 구성원을 검출하기 위해 IHC 기술을 최적화했습니다. 우리는 주로 고정, 두 가지 접근법을 사용하여 조직 포함, 단면화 및 장착 (현미경 분석 중 해상도 및 세부 사항에 영향을 미칠 수 있음), 및 차단 (거짓 긍정을 방지하고 배경을 줄이기 위해)14. 다른 중요한 특성은 개별 IHC 프로토콜의 항체 특이성 및 선택성 및 재현성이다. 항체 특이성을 제공하는 열쇠는 음성 대조군(표적 단백질을 발현하지 않는 것으로 알려진 1차 항체 또는 조직을 포함하지 않음)뿐만 아니라 양성 대조군(표적 단백질을 발현하는 것으로 알려진 조직 포함)의 사용이다15 . IHC에 대한 항체의 선택은 그들의 종 특이성 (관심있는 항원과 반응할 가능성) 및 4,5,6에 사용되는 항원 항체 결합 검출 시스템에 기초하여 이루어집니다. ,7. 면역페록시다아제의 경우, 반응의 색은 침전 염색체, 보통 디아미노벤지딘(brown)16의선택에 의해 결정된다. 한편, immunofluorescence는 형광체와 공액된 항체를 활용하여 동결 조직 섹션에서 단백질 발현을 시각화하고 염색체 검출 시스템에 대하여 여러 단백질을 쉽게 분석할 수 있습니다. 5개 , 7.

면역페록시다아제 기술에서, 이차 항체는 염색체 리포터 분자[아비딘-비오틴 복합체(ABC)]를 모집할 수 있는 링커 분자인 비오틴에 공액화되어 염색 신호의 증폭을 유도한다. ABC 리포터 방법을 사용하면 효소 과산화 효소가 3,3′-다미노 벤지딘 (DAB)과 반응하여 효소가 이차 항체에 결합하는 강렬한 갈색 염색을 생성하여 일반 광 현미경으로 분석 할 수 있습니다. ABC 염색은 비오틴에 대한 아비딘의 높은 친화도 때문에 1 차 항체 반응성의 부위에 부착된 이차 항체가 거의 없는 신속하고 최적의 반응을 생성합니다. 이러한 발색 검출 방법은 신호의 밀도 분석을 허용하고, 단백질 발현 수준18과갈색 신호 수준의 상관관계에 기초하여 반정량적 데이터를 제공한다.

면역형광 기술을 사용하면 독특한 파장에서 빛을 방출하는 다양한 형광화의 능력으로 인해 여러 단백질을 동시에 검출할 수 있지만 스펙트럼 중복을 최소화하기 위해 형광화를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 5.또한, 상이한 숙주 종에서 1차 항체의 사용은 교차 반응성에 관한 어려움을 최소화한다. 이 경우, 각 종 특이적 이차 항체는 1차 항체의 한 가지 유형만을 인식한다. 형광 리포터는 알렉사 플루오르 염료와 같은 상업적 유도체를 포함하는 작은 유기 분자이다.

많은 동물 모델은 특정 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는 데 사용됩니다. 현재까지, 많은 신진 대사 경로 진화의 과정을 통해 보존 설립. 따라서, 제브라피시와 같은 모델 유기체에 대한 IHC 연구는 병리학적 및 비병리학적 조건의 기원 및 유지에 대한 통찰력을 제공할 수 있다17. 이 보고서의 목적은 성인 제브라피시 조직에서 수행될 수 있는 IHC 프로토콜을 설명하고 주변 및 중앙 수준에서 OXA, OX-2R 및 CB1R의 분포 및 국소화에 대한 상세한 이미지를 얻는 데 사용됩니다. 또한 성인 제브라피시의 말초 및 중앙 조직에서 두 가지 주요 IHC 간접 방법의 적용을 위한 프로토콜이 보고되었다. 설명된 간접 방법은 이차 항체가 형광 염료(면역형광 법) 또는 효소 리포터(면역페록시다아제 방법)에 공액화되는 경우에 신호 증폭을 허용하는 방법이다. 발색성 및 형광 검출 방법 모두 장점과 단점을 가지고 있습니다. 이 프로토콜에 보고된 것은 IHC의 사용, 주로 면역형광, 성인 제브라피시, 상이한 생리학적 및 병리학적 조건에 걸쳐 진화적으로 보존되는 시스템을 연구하는 데 널리 사용되는 동물 모델이다.

Protocol

1. 면역페록시다아제 프로토콜 참고 : 제브라피쉬는 오미드 사파리 교수 (수산학과, 천연 자원 및 환경 학부, 마슈하드, 마슈하드, 이란 의 페르도우시 대학)에 의해 얻어졌다10. 조직 해부 얼음물에 침수하여 제브라피시를 희생 (5 부분 얼음 / 1 부분 물, 4 ° C); 저산소증에 의한 죽음을 보장하기 위해 모든 운동이 중단 될 때까지 그?…

Representative Results

면역페록시다아제 염색에 대한 대표적인 데이터는 도 1 및 도 2에도시되어 있다. 성인 제브라피시의 장에서 OX-A 및 OX-2R 분포의 면역조직화학적 분석은 DIO 제브라피시의 장세포에서의 OX-A 및 OX-2R의 상이한 국소화 부위 및 이들의 발현 증가를 보여주었다. OX-A에 대한 강렬한 갈색 염색은 내측 및 전방 장의 세포에서 관찰되었다 (도1A,</stron…

Discussion

샘플 준비

시료 전형은 IHC의 첫 번째 중요한 단계입니다. 신뢰할 수 있는 프로토콜을 통해 세포 형태, 조직 구조 및 항원성을 유지보수할 수 있습니다. 이 단계는 올바른 조직 수집, 고정및 절편22,23이필요합니다. 고정의 목적은 조직을 보존하고 조직 효소 또는 미생물의 작용을 감소시키는 것입니다. 특히, 고정 단…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 폰디 리체르카 디 아테네오 (FRA)에 의해 지원되었다 2015-2016, 산니오 대학.

Materials

Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603
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Imperatore, R., D’Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).
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