Identificazione dei recettori Orexin ed Endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza

Summary

Sono presentati qui i protocolli per la caratterizzazione immunohistochimica e la localizzazione di peptidi orexin, recettori dell’orexina e recettori endocannabinoidi nell’intestino e nel cervello dei modelli di obesità adulta (DIO) normali e indotta dalla dieta immunoperissiasi e metodi di doppia immunofluorescenza.

Abstract

L’immunohistochimica (IHC) è una tecnica altamente sensibile e specifica coinvolta nella rilevazione di antigeni bersaglio nelle sezioni tissutali con anticorpi etichettati. Si tratta di un processo multifase in cui l’ottimizzazione di ogni passo è fondamentale per ottenere il segnale specifico ottimale. Attraverso l’IHC, è possibile rilevare la distribuzione e la localizzazione di biomarcatori specifici, rivelando informazioni sulla conservazione evolutiva. Inoltre, L’IHC consente di comprendere i cambiamenti di espressione e distribuzione dei biomarcatori in condizioni patologiche, come l’obesità. L’IHC, principalmente la tecnica dell’immunofluorescenza, può essere utilizzato nel pesce zebra adulto per rilevare l’organizzazione e la distribuzione di molecole conserve filogeneticamente conservate, ma un protocollo IHC standard non è estasblished. Orexin ed endocannabinoidi sono due sistemi altamente conservati coinvolti nel controllo dell’assunzione di cibo e patologia dell’obesità. Riportati qui sono protocolli utilizzati per ottenere informazioni sul peptide orexin (OXA), recettore dell’orexin (OX-2R), e il recettore cannabinoide (CB1R) localizzazione e distribuzione nell’intestino e nel cervello di normali e indotti dalla dieta obeso (DIO) modelli di pesce zebra adulti. Sono inoltre descritti i metodi per l’immunoperossiasi e la doppia immunofluorescenza, nonché la preparazione di reagenti, la fissazione, l’incorporazione di paraffina e la crioprotezione del tessuto del pesce zebra e la preparazione per una fase endogena di blocco dell’attività e controstatura. L’insieme completo dei parametri è ottenuto da precedenti esperimenti IHC, attraverso i quali abbiamo dimostrato come l’immunofluorescenza può aiutare con la comprensione di OX, OX-2R, e distribuzione CB1R, localizzazione, e conservazione dell’espressione nel pesce zebra adulto Tessuti. Le immagini risultanti con intensità del segnale altamente specifico hanno portato alla conferma che i pesci zebra sono modelli animali adatti per studi immunohistochimici di distribuzione, localizzazione e conservazione evolutiva di biomarcatori specifici condizioni fisiologiche e patologiche. I protocolli qui presentati sono consigliati per gli esperimenti IHC nel pesce zebra adulto.

Introduction

L’immunohistochimica (IHC) è una tecnica classica ben consolidata utilizzata per identificare i componenti cellulari o tissutali (antigeni) dall’interazione antigene-anticorpo^1,2. Può essere utilizzato per identificare la localizzazione e la distribuzione di biomolecole bersaglio all’interno di un tessuto. L’IHC utilizza reazioni immunologiche e chimiche per rilevare gli antigeni nelle sezioni tissutali³. I principali marcatori utilizzati per la visualizzazione delle interazioni antigene-anticorpo includono coloranti fluorescenti (immunofluorescenza) e reazioni di colore enzimatico-substrato (immunoperossiasi), entrambe coniugate agli anticorpi⁴. Utilizzando l’osservazione microscopica è possibile determinare la localizzazione del tessuto etichettato, che corrisponde approssimativamente alla localizzazione dell’antigene bersaglio nel tessuto.

Esistono due metodi per le reazioni fluorescenti o cromogeniche per rilevare le proteine: il metodo di rilevamento diretto, in cui l’anticorpo primario specifico è etichettato direttamente; e il metodo di rilevamento indiretto, in cui l’anticorpo primario è non coniugato mentre l’anticorpo secondario porta l’etichetta^5,6,7. Il metodo indiretto ha alcuni vantaggi, che è principalmente la sua amplificazione del segnale. Inoltre, a differenza di altre tecniche molecolari e cellulari, con l’immunofluorescenza, è possibile visualizzare la distribuzione, la localizzazione e la coespressione di due o più proteine espresse in modo differenziale all’interno di cellule e tessuti⁷. La scelta del metodo di rilevamento utilizzato dipende dai dettagli sperimentali.

Ad oggi, IHC è ampiamente utilizzato nella ricerca di base come uno strumento potente ed essenziale per comprendere la distribuzione e la localizzazione dei biomarcatori e la profilazione generale di diverse proteine nel tessuto biologico dall’uomo agli invertebrati^{8, 9} (in vie ^{, 10} del sistema ^{, 11}. La tecnica aiuta a visualizzare una mappa dell’espressione proteica in un gran numero di organi animali normali e alterati e diversi tipi di tessuto, mostrando possibili down o up-regolazione dell’espressione indotta da cambiamenti fisiologici e patologici. IHC è una tecnica altamente sensibile che richiede precisione e la corretta scelta dei metodi per ottenere risultati ottimali¹². Prima di tutto, molti fattori diversi come la fissazione, la reattività incrociata, il recupero dell’antigene e la sensibilità degli anticorpi possono portare a falsi segnali positivi e falsi negativi¹³. La selezione degli anticorpi è uno dei passi più importanti in IHC e dipende dalla specificità dell’antigene e dalla sua affinità con le proteine e le specie in esame⁷.

Recentemente, abbiamo ottimizzato la tecnica IHC per rilevare i membri dei sistemi orexin/ipocretin e endocannabinoidi nel tessuto ringiovanito del pesce zebra. Ci siamo concentrati principalmente sulla fissazione, l’incorporamento dei tessuti utilizzando due approcci diversi, il sezionamento e il montaggio (che possono influenzare la risoluzione e il dettaglio durante l’analisi microscopica) e il blocco (per prevenire falsi positivi e ridurre lo sfondo)¹⁴. Altre caratteristiche importanti sono la specificità dell’anticorpo e la selettività e riproducibilità dei singoli protocolli IHC. La chiave per fornire la specificità degli anticorpi è l’uso di controlli negativi (compresi gli anticorpi primari o i tessuti che è noto per non esprimere le proteine bersaglio) e controlli positivi (compresi i tessuti che è noto per esprimere le proteine bersaglio)¹⁵ . La selezione degli anticorpi per l’IHC viene effettuata in base alla loro specificità delle specie (la probabilità con cui reagiscono con l’antigene di interesse) e ai sistemi di rilevazione antigene-anticorpo utilizzati^{4,5,6 ,7}. Nel caso dell’immunoperossia, il colore della reazione è determinato dalla selezione del cromogeno precipitante, di solito diaminobenzidina (marrone)¹⁶. D’altra parte, immunofluorescencence utilizza anticorpi coniugati con un fluorophor per visualizzare l’espressione delle proteine in sezioni di tessuto congelato e consente una facile analisi di più proteine rispetto al sistema di rilevamento cromogenico ⁵ Del numero 3( ^{, 7}.

Nella tecnica dell’immunoperossiasi, l’anticorpo secondario viene coniugato alla biotina, una molecola del linker in grado di reclutare una molecola di reporter cromatogeno [complesso avidino-biotina (ABC)], che porta all’amplificazione del segnale di colorazione. Con il metodo reporter ABC, l’enzima perossidasi reagisce con 3,3′-diaminobenzidina (DAB), producendo una colorazione intensamente marrone dove l’enzima si lega all’anticorpo secondario, che può quindi essere analizzato con un microscopio luminoso ordinario. La colorazione ABC, a causa dell’alta affinità dell’avidina per la biotina, produce una reazione rapida e ottimale, con pochi anticorpi secondari attaccati al sito della reattività primaria dell’anticorpo. Questo metodo di rilevamento cromogenico consente l’analisi densitometrica del segnale, fornendo dati semiquantitativi basati sulla correlazione dei livelli di segnale marrone con i livelli di espressione delle proteine¹⁸.

Con le tecniche di immunofluorescenza, il rilevamento simultaneo di più proteine è possibile grazie alla capacità di fluorocromi diversi di emettere luce a lunghezze d’onda uniche, ma è importante scegliere con attenzione i fluorocromi per ridurre al minimo la sovrapposizione ^{spettrale 5}. Inoltre, l’uso di anticorpi primari in diverse specie ospiti riduce al minimo le difficoltà relative alla reattività incrociata. In questo caso, ogni anticorpo secondario specifico della specie riconosce solo un tipo di anticorpo primario. I reporter fluorescenti sono piccole molecole organiche, compresi i derivati commerciali, come i coloranti Alexa Fluor.

Molti modelli animali sono utilizzati per comprendere particolari condizioni fisiologiche e patologiche. Ad oggi, è stabilito che molte vie metaboliche sono conservate nel corso dell’evoluzione. Pertanto, gli studi IHC in organismi modello come il pesce zebra possono fornire informazioni sulla genesi e il mantenimento delle condizioni patologiche e non patologiche¹⁷. L’obiettivo di questa relazione è illustrare i protocolli IHC che possono essere eseguiti sul tessuto del pesce zebra adulto e utilizzati per ottenere immagini dettagliate della distribuzione e localizzazione di OXA, OX-2R e CB1R a livello periferico e centrale. Sono riportati anche protocolli per l’applicazione di due principali metodi indiretti IHC nei tessuti periferici e centrali del pesce zebra adulto. Descritto è il metodo indiretto, che consente l’amplificazione del segnale nei casi in cui un anticorpo secondario viene coniugato a un tintura fluorescente (metodo di immunofluorescenza) o reporter enzimatico (metodo immunoperossidasi). Entrambi i metodi cromogenici e fluorescenti di rilevamento possiedono vantaggi e svantaggi. Riportato in questo protocollo è l’uso di IHC, principalmente immunofluorescenza, nel pesce zebra adulto, un modello animale ampiamente utilizzato per studiare i sistemi che sono evolutivi conservati in diverse condizioni fisiologiche e patologiche.

Protocol

1. Protocollo immunoperossiasi NOTA: Il pesce zebra sono stati ottenuti dal professor Omid Safari (Dipartimento della Pesca, Facoltà di Risorse Naturali e Ambiente, Ferdowsi Università di Mashhad, Mashhad, Iran)10. Dissezione dei tessuti Sacrificare il pesce zebra per sommersione nell’acqua ghiacciata (5 parti di ghiaccio/1 parte di acqua, 4 gradi centigradi); lasciarli fino alla cessazione di tutti i movimenti per garantire la mor…

Representative Results

I dati rappresentativi per la colorazione immunoperossia sono riportati nella figura 1 e nella figura 2. L’analisi immunoistochimica della distribuzione OX-A e OX-2R nell’intestino del pesce zebra adulto ha mostrato diversi siti di localizzazione di OX-A e OX-2R e il loro aumento nell’espressione nelle cellule intestinali del pesce zebra DIO. Una colorazione marrone intensa per OX-A è stata osservata nelle cellule dell’intestino mediale e anteriore (<strong cla…

Discussion

Preparazione del campione

La preparazione del campione è il primo passaggio critico in IHC. Un protocollo affidabile consente la manutenzione della morfologia cellulare, dell’architettura dei tessuti e dell’antigenicità. Questo passaggio richiede la corretta raccolta dei tessuti, la fissazione e la sezionamento^22,23. Lo scopo della fissazione è quello di preservare il tessuto e ridurre l’azione di enzimi tiss…

Materials

Anti CB1	Abcam	ab23703
Anti OX-2R	Santa Cruz	sc-8074
Anti-OXA	Santa Cruz	sc8070
Aquatex	Merck	1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat	Vector Lab	BA-5000
citric acid	Sigma Aldrich	251275
Confocal microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti2
Cryostat	Leica Biosystem	CM3050S
DAPI	Sigma Aldrich	32670
Digital Camera	Leica Biosystem	DFC320
Digital Camera for confocal microscope	Nikon	DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A21207
Ethanol absolute	VWR	20,821,330
Frozen section compound	Leica Biosystem	FSC 22 Frozen Section Media
H2O2	Sigma Aldrich	31642
HCl	VWR	20,252,290
ImmPACT DAB	Vector lab	SK4105
Microscope	Leica Biosystem	DMI6000
Microtome	Leica Biosystem	RM2125RT
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
NaH2PO4H2O	Sigma Aldrich	S9638
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
Normal Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Normal Rabbit Serum	Vector lab	S-5000
paraffin wax	Carlo Erba	46793801
Paraphormaldeyde	Sigma Aldrich	P6148
sodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	W302600
Triton X-100	Fluka Analytical	93420
Trizma	Sigma Aldrich	T1503
VectaStain Elite ABC Kit	Vector lab	PK6100
Xylene Pure	Carlo Erba	392603