Identifisering av orexin og Endocannabinoid reseptorer i Adult sebrafisk bruke Immunoperoxidase og Immunofluorescence metoder

Summary

Presentert her er protokoller for immunhistokjemiske karakterisering og lokalisering av orexin peptid, orexin reseptorer, og endocannabinoid reseptorer i tarmen og hjernen av normal og diett-indusert fedme (DIO) voksen sebrafisk modeller ved hjelp immunoperixidase og doble immunofluorescence metoder.

Abstract

Immunhistokjemi (IHC) er en svært følsom og spesifikk teknikk som er involvert i påvisning av mål antigener i vevs seksjoner med merket antistoffer. Det er en flertrinnsprosess der optimaliseringen av hvert trinn er avgjørende for å oppnå optimal bestemt signal. Gjennom IHC, distribusjon og lokalisering av spesifikke biomarkører kan oppdages, avslørende informasjon om evolusjonære bevaring. Videre tillater IHC for forståelsen av uttrykk og distribusjon endringer av biomarkører i patologiske tilstander, som fedme. IHC, hovedsakelig immunofluorescence teknikk, kan brukes i voksen sebrafisk for å oppdage organisering og distribusjon av phylogenetically bevarte molekyler, men en standard IHC protokoll er ikke estasblished. Orexin og endocannabinoid er to svært bevarte systemer involvert i kontroll av matinntak og fedme patologi. Rapportert her er protokoller som brukes til å innhente informasjon om orexin peptid (OXA), orexin reseptor (okse-2R), og cannabinoid reseptor (CB1R) lokalisering og distribusjon i tarmen og hjernen av normal og diett-indusert overvektige (DIO) voksen sebrafisk modeller. Også beskrevet er metoder for immunoperoxidase og dobbel immunofluorescence, samt utarbeidelse av reagenser, fiksering, parafin-embedding, og cryoprotection av sebrafisk vev og forberedelse til en endogene aktivitet-blokkering trinn og bakgrunn counterstaining. Det komplette sett av parametre er innhentet fra tidligere IHC eksperimenter, der vi har vist hvordan immunofluorescence kan hjelpe med forståelsen av OXs, okse-2R, og CB1R distribusjon, lokalisering og bevaring av uttrykk i voksen sebrafisk Vev. Det resulterer profilen med høylig spesifikk signal intensiteten smal avsats å bekreftelsen det sebrafisk er passende dyr modeller for immunhistokjemiske studier av distribusjon, lokaliseringen, og evolusjonær bevaring av spesifikk biomarkører inne fysiologiske og patologiske tilstander. Protokollene som presenteres her anbefales for IHC eksperimenter i voksen sebrafisk.

Introduction

Immunhistokjemi (IHC) er en veletablert klassisk teknikk som brukes for å identifisere cellulære eller vevs komponenter (antigener) ved antigen-antistoff interaksjon^1,2. Den kan brukes til å identifisere lokalisering og distribusjon av målet biomolekyler innenfor en vev. IHC bruker immunologiske og kjemiske reaksjoner for å detektere antigener i vevs seksjoner³. De viktigste markører som brukes for visualisering av antigen-antistoff interaksjoner inkluderer fluorescerende fargestoffer (immunofluorescence) og enzym-substrat farge reaksjoner (immunoperoxidase), begge bøyd til antistoffer⁴. Ved hjelp av mikroskopisk observasjon er mulig å bestemme lokalisering av merket vev, som omtrent tilsvarer lokalisering av målet antigen i vevet.

Det finnes to metoder for fluorescerende eller kromogen reaksjoner for å påvise protein: direkte deteksjons metoden, der det spesifikke primære antistoff er direkte merket; og den indirekte deteksjons metoden, der det primære antistoff er unconjugated mens det sekundære antistoff bærer etiketten^5,6,7. Den indirekte metoden har noen fordeler, som er hovedsakelig dens signal forsterkning. Videre, i motsetning til andre molekylære og cellulære teknikker, med immunofluorescence, er det mulig å visualisere fordelingen, lokalisering og coexpression av to eller flere proteiner differensielt uttrykt i celler og vev⁷. Valget av deteksjons metoden som brukes avhenger av eksperimentelle detaljer.

Hittil er IHC mye brukt i grunnleggende forskning som et kraftig og viktig verktøy for å forstå distribusjon og lokalisering av biomarkører og den generelle profilering av ulike proteiner i biologisk vev fra menneske til virvelløse dyr^{8, 9} andre priser ^{, 10} andre ^{, 11}. teknikken bidrar til å vise et kart over protein uttrykk i et stort antall normale og endrede dyre organer og ulike vevstyper, viser mulig ned-eller opp-regulering av uttrykk indusert av fysiologiske og patologiske forandringer. IHC er en svært følsom teknikk som krever nøyaktighet og riktig valg av metoder for å oppnå optimale resultater¹². Først av alt, mange forskjellige faktorer som fiksering, Cross-reaktivitet, antigen gjenfinning, og følsomhet for antistoffer kan føre til falske positive og falske negative signaler¹³. Valg av antistoffer er en av de viktigste trinnene i IHC og avhenger av antigen spesifisitet og dens affinitet til protein og arter under etterforskning⁷.

Nylig har vi optimalisert IHC teknikk for å oppdage medlemmer av orexin/hypocretin og endocannabinoid systemer i voksen sebrafisk vev. Vi har hovedsakelig fokusert på fiksering, vevs innebygging med to ulike tilnærminger, snitting og montering (som kan påvirke oppløsning og detaljer under mikroskopisk analyse), og blokkering (for å forhindre falske positiver og redusere bakgrunnen)¹⁴. Andre viktige egenskaper er antistoff spesifisitet og selektivitet og reproduserbarhet for individuelle IHC protokoller. Nøkkelen til å gi antistoff spesifisitet er bruken av negative kontroller (inkludert ingen primære antistoffer eller vev som er kjent for å ikke uttrykke målet proteiner) så vel som positive kontroller (inkludert vev som er kjent for å uttrykke målet proteiner)¹⁵ . Valget av antistoffer for IHC er gjort basert på deres arter-spesifisitet (sannsynligheten som de reagerer med antigen av interesse) og antigen-antistoff binding Detection systemer som brukes^{4,5,6 ,7}. I tilfelle av immunoperoxidase, er fargen på reaksjonen bestemmes av valg av fremskynde kromogen, vanligvis diaminobenzidine (brun)¹⁶. På den andre side, jegmmunofluorescence utnytter Antistoffene bøyd med en fluorophor å visualisere protein gjengivelsen inne frosset tissue avdelinger og innrømmer for lett analyse av mangfoldig protein med hensyn til det kromogen oppdagelsen system ⁵ andre priser ^{, 7}i.

I immunoperoxidase teknikk, den sekundære antistoff er bøyd til biotin, en linker molekyl stand til å rekruttere en kromogen reporter molekyl [avidin-biotin kompleks (ABC)], som fører til forsterkning av fargesignalet. Med ABC reporter-metoden, reagerer enzymet peroksidase med 3, 3 ‘-diaminobenzidine (DAB), produserer en intenst brun-farget flekker der enzymet binder seg til den sekundære antistoff, som deretter kan analyseres med en vanlig lys mikroskop. ABC farging, på grunn av den høye affinitet av avidin for biotin, produserer en rask og optimal reaksjon, med få sekundære antistoffer knyttet til stedet for den primære antistoff reaktivitet. Denne kromogen gjenkjennings metoden tillater densitometric analyse av signalet, og gir semi-kvantitative data basert på korrelasjon av brune signal nivåer med protein uttrykk nivåer¹⁸.

Med immunofluorescence teknikker, er samtidig påvisning av flere proteiner mulig på grunn av evnen til forskjellige fluorokromer å avgi lys på unike bølgelengder, men er viktig å velge fluorokromer nøye for å minimere Spectral overlapping ⁵. i tillegg minimerer bruken av primære antistoffer i forskjellige verts arter vanskeligheter vedrørende kryss reaktivitet. I dette tilfellet gjenkjenner hvert Arts spesifikt sekundært antistoff bare én type primær antistoff. Fluorescerende journalister er små organiske molekyler, inkludert kommersielle derivater, for eksempel Alexa fluor fargestoffer.

Mange dyremodeller brukes til å forstå spesielle fysiologiske og patologiske tilstander. Hittil er det fastslått at mange metabolske trasé er bevart i løpet av utviklingen. Derfor kan IHC studier i modell organismer som sebrafisk gi innsikt i Genesis og vedlikehold av patologiske og ikke-patologiske tilstander¹⁷. Det er et mål for denne rapporten å illustrere IHC protokoller som kan utføres på voksen sebrafisk vev og brukes til å få detaljerte bilder av distribusjon og lokalisering av OXA, okse-2R, og CB1R på perifere og sentrale nivåer. Også rapportert er protokoller for anvendelse av to store IHC indirekte metoder i perifere og sentrale vev av voksne sebrafisk. Beskrevet er den indirekte metoden, som gir mulighet for signal forsterkning i tilfeller der et sekundært antistoff blir bøyd til et fluorescerende fargestoff (immunofluorescence metode) eller enzym reporter (immunoperoxidase metode). Både kromogen og fluorescerende deteksjonsmetoder besitter fordeler og ulemper. Rapportert i denne protokollen er bruk av IHC, hovedsakelig immunofluorescence, i voksen sebrafisk, en dyr modell mye brukt til å studere systemer som er evolusjonære bevart på tvers av ulike fysiologiske og patologiske forhold.

Protocol

1. Immunoperoxidase protokoll Merk: sebrafisk ble innhentet av Prof Omid Safari (Department of Fisheries, Fakultet for naturressurser og miljø, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran)10. Vev disseksjon Ofre sebrafisk ved å bli i isvann (5 deler is/1 del vann, 4 ° c); forlate dem til opphør av all bevegelse for å sikre død ved hypoksi. Fjern raskt tarmen og hjernen med følgende disseksjon metode: Tørk…

Representative Results

Representative data for immunoperoxidase flekker er vist i figur 1 og figur 2. Immunhistokjemiske analyse av OX-A og okse-2R distribusjon i tarmen av voksen sebrafisk viste ulike lokalisering steder av OX-A og okse-2R og deres øker i uttrykket i tarm celler av DIO sebrafisk. En intens brun farging for OX-A ble observert i cellene i midtre og fremre tarmen (figur 1a, A1). Immunoexpression av okse-A ga klare signaler i de …

Discussion

Eksempel på tilberedning

Forberedelse av prøver er det første kritiske trinnet i IHC. En pålitelig protokoll tillater vedlikehold av celle morfologi, vevs arkitektur og antigenisiteten. Dette trinnet krever riktig vevs oppsamling, fiksering og snitting^22,23. Formålet med fiksering er å bevare vev og redusere virkningen av vev enzymer eller mikroorganismer. Spesielt bevarer fikserings trinnet cellulære kom…

Materials

Anti CB1	Abcam	ab23703
Anti OX-2R	Santa Cruz	sc-8074
Anti-OXA	Santa Cruz	sc8070
Aquatex	Merck	1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat	Vector Lab	BA-5000
citric acid	Sigma Aldrich	251275
Confocal microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti2
Cryostat	Leica Biosystem	CM3050S
DAPI	Sigma Aldrich	32670
Digital Camera	Leica Biosystem	DFC320
Digital Camera for confocal microscope	Nikon	DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A21207
Ethanol absolute	VWR	20,821,330
Frozen section compound	Leica Biosystem	FSC 22 Frozen Section Media
H2O2	Sigma Aldrich	31642
HCl	VWR	20,252,290
ImmPACT DAB	Vector lab	SK4105
Microscope	Leica Biosystem	DMI6000
Microtome	Leica Biosystem	RM2125RT
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
NaH2PO4H2O	Sigma Aldrich	S9638
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
Normal Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Normal Rabbit Serum	Vector lab	S-5000
paraffin wax	Carlo Erba	46793801
Paraphormaldeyde	Sigma Aldrich	P6148
sodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	W302600
Triton X-100	Fluka Analytical	93420
Trizma	Sigma Aldrich	T1503
VectaStain Elite ABC Kit	Vector lab	PK6100
Xylene Pure	Carlo Erba	392603