JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Identifiering av Orexin och Endocannabinoid receptorer hos vuxna zebra fiskar med Immunoperoxidas och immunofluorescens metoder

Published: June 25, 2019
doi:
10.3791/59308
, , , ,
1Department of Sciences and Technologies (DST),University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group,Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions,University of Naples Federico II

Summary

Presenteras här är protokoll för immunhistokemisk karakterisering och lokalisering av Orexin peptid, Orexin receptorer, och endocannabinoida receptorer i tarmen och hjärnor normala och kost-inducerad fetma (DIO) vuxna zebra fisk modeller med immunoperixidas och dubbla immunofluorescens-metoder.

Abstract

Immunhistokemi (IHC) är en mycket känslig och specifik teknik som är involverad i upptäckten av mål antigener i vävnads sektioner med märkta anti kroppar. Det är en process i flera steg där optimeringen av varje steg är avgörande för att få den optimala specifika signalen. Genom IHC kan distributionen och lokaliseringen av specifika bio markörer upptäckas, vilket avslöjar information om evolutionärt bevarande. Dessutom möjliggör IHC förståelsen av förändringar i uttryck och distribution av bio markörer vid sjukdoms tillstånd, såsom fetma. IHC, främst immunofluorescens teknik, kan användas i vuxen zebra fiskar att upptäcka organisation och distribution av fylogenetiskt bevarade molekyler, men en standard IHC-protokollet är inte estasblished. Orexin och endocannabinoida är två mycket bevarade system som deltar i kontrollen av födo intag och fetma patologi. Rapporterade här är protokoll som används för att få information om Orexin peptid (OXA), Orexin receptor (OX-2R), och cannabinoid receptor (CB1R) lokalisering och distribution i tarmen och hjärnan av normal och diet-inducerad feta (DIO) vuxen zebra fisk modeller. Dessutom beskrivs metoder för immunoperoxidas och dubbel immunofluorescens, samt beredning av reagenser, fixering, paraffin-inbäddning, och krysskydd av zebra fiskar vävnad och förberedelse för ett endogent aktivitet-blockerande steg och bakgrund motfärgning. Den kompletta uppsättningen parametrar erhålls från tidigare IHC experiment, genom vilka vi har visat hur immunofluorescens kan hjälpa till med förståelsen av OXS, ox-2R, och CB1R distribution, lokalisering, och bevarande av uttryck i vuxen zebra fiskar Vävnader. De resulterande bilderna med mycket specifik signalintensitet ledde till bekräftelsen att zebra fiskar är lämpliga djur modeller för immunhistokemiska studier av distribution, lokalisering och evolutionärt bevarande av specifika bio markörer i fysiologiska och patologiska tillstånd. De protokoll som presenteras här rekommenderas för IHC experiment i vuxen Zebrafish.

Introduction

Immunhistokemi (IHC) är en väletablerad klassisk teknik som används för att identifiera cellulära eller vävnads komponenter (antigener) genom antigen-antikroppsinteraktion1,2. Den kan användas för att identifiera lokalisering och distribution av målbiomoleculer inom en vävnad. IHC använder immunologiska och kemiska reaktioner för att detektera antigener i vävnads avsnitt3. De viktigaste markörer som används för visualisering av antigen-antikroppinteraktioner inkluderar fluorescerande färg ämnen (immunofluorescens) och enzym-substrat färg reaktioner (immunoperoxidas), båda konjugerade till anti kroppar4. Med hjälp av mikroskopisk observation är möjligt att bestämma lokalisering av märkt vävnad, som ungefär motsvarar lokalisering av målet antigen i vävnaden.

Det finns två metoder för fluorescerande eller kromogena reaktioner för att detektera protein: den direkta detektions metoden, där den specifika primära anti kroppen är direkt märkt; och den indirekta detektions metoden, där den primära anti kroppen är okonjugerad medan den sekundära anti kroppen bär etiketten5,6,7. Den indirekta metoden har några fördelar, som är främst dess signalamplifiering. Dessutom, till skillnad från andra molekyl ära och cellulära tekniker, med immunofluorescens, är det möjligt att visualisera distribution, lokalisering och kouttryck av två eller flera proteiner differentially uttrycks i celler och vävnader7. Valet av vilken detektions metod som används beror på experimentella detaljer.

Hittills är IHC allmänt används i grund forskning som ett kraftfullt och viktigt verktyg för att förstå distribution och lokalisering av bio markörer och den allmänna profilering av olika proteiner i biologisk vävnad från människa till ryggradslösa djur8, 9 för att , 10 , 11. tekniken hjälper till att visa en karta över protein uttryck i ett stort antal normala och förändrade djur organ och olika vävnads typer, som visar möjlig ned-eller uppreglering av uttryck som induceras av fysiologiska och patologiska förändringar. IHC är en mycket känslig teknik som kräver noggrannhet och rätt val av metoder för att uppnå optimala resultat12. Först av allt, många olika faktorer såsom fixering, cross-reaktivitet, antigen hämtning, och känslighet av anti kroppar kan leda till falskt positiva och falska negativa signaler13. Val av anti kroppar är ett av de viktigaste stegen i IHC och beror på antigen specificitet och dess affinitet till proteinet och arten under utredning7.

Nyligen har vi optimerat IHC teknik för att upptäcka medlemmar av Orexin/hypokretin och endocannabinoida system i vuxen zebra fiskar vävnad. Vi har främst fokuserat på fixering, vävnad inbäddning med två olika metoder, snittning och montering (som kan påverka upplösning och Detaljer under Mikroskopisk analys), och blockering (för att förhindra falska positiva och minska bakgrunden)14. Andra viktiga egenskaper är anti kroppspecificiteten och selektiviteten och reproducerbarheten hos enskilda IHC-protokoll. Nyckeln till att ge anti kropps specificitet är användningen av negativa kontroller (inklusive inga primära anti kroppar eller vävnad som är kända för att inte uttrycka mål proteiner) samt positiva kontroller (inklusive vävnad som är kända för att uttrycka mål proteiner)15 . Valet av anti kroppar mot IHC görs på grund val av deras artspecificitet (sannolikheten för att de reagerar med antigen av intresse) och de antigen-antikroppbindningssystem som används4,5,6 ,7. När det gäller immunoperoxidas bestäms färgen på reaktionen genom selektion av den utfällande kromogenen, vanligt vis diaminobenzidin (brun)16. Å andra sidan, jagmmunofluorescence använder anti kroppar konjugerade med en fluorophor att visualisera protein uttryck i frysta vävnad sektioner och möjliggör enkel analys av flera proteiner med avseende på kromogena detektions systemet 5 den femte , och 7.

I immunoperoxidastekniken konjugeras den sekundära anti kroppen med biotin, en linkermolekyl som kan rekrytera en kromogen reporter molekyl [avidin-biotin Complex (ABC)], vilket leder till förstärkning av infärgnings signalen. Med ABC reporter metod, reagerar enzymet peroxidas med 3, 3 ‘-diaminobenzidine (DAB), producerar en intensivt brunfärgad färgning där enzymet binder till den sekundära anti kroppen, som sedan kan analyseras med en vanlig ljus Mikroskop. ABC-färgning, på grund av den höga affinitet av avidinen för Biotin, ger en snabb och optimal reaktion, med några sekundära anti kroppar som är knutna till platsen för den primära anti kropps reaktiviteten. Denna kromogena detektions metod möjliggör Densitometrisk analys av signalen, vilket ger semi-kvantitativa data baserat på sambandet mellan bruna signal nivåer och protein uttrycks nivåer18.

Med immunofluorescensteknik är samtidig detektion av multipla proteiner möjlig på grund av olika fluorchromes förmåga att avge ljus vid unika våg längder, men det är viktigt att noggrant välja fluorokromer för att minimera spektralöverlappning 5. Dessutom minimerar användningen av primära anti kroppar hos olika värd arter svårigheterna när det gäller kors reaktivitet. I detta fall identifierar varje artspecifik sekundär anti kropp endast en typ av primär anti kropp. Fluorescerande reportrar är små organiska molekyler, inklusive kommersiella derivat, såsom Alexa fluor färg ämnen.

Många djur modeller används för att förstå särskilda fysiologiska och sjukdoms tillstånd. Hittills är det fastställt att många metaboliska vägar bevaras under evolutionens gång. Därför kan IHC-studier i modellorganismer som zebra fisk ge insikt i uppkomsten och upprätthållandet av patologiska och icke-patologiska villkor17. Det är ett syfte med denna rapport att illustrera IHC protokoll som kan utföras på vuxna zebra fiskar vävnad och används för att få detaljerade bilder av distribution och lokalisering av Oxa, ox-2R, och CB1R på perifera och centrala nivåer. Också rapporter ATS är protokoll för tillämpning av två stora IHC indirekta metoder i perifera och centrala vävnader av vuxna Zebrafish. Beskrivs är den indirekta metoden, som möjliggör signalamplifiering i fall där en sekundär anti kropp konjugeras till ett fluorescerande färg ämne (immunofluorescens metod) eller enzym reporter (immunoperoxidasmetoden). Både kromogena och fluorescerande detektions metoder besitter fördelar och nack delar. Rapporterat i detta protokoll är användningen av IHC, främst immunofluorescens, i vuxen Zebrafish, en djur modell som ofta används för att studera system som är evolutionär bevaras över olika fysiologiska och patologiska förhållanden.

Protocol

1. immunoperoxidasprotokoll Obs: den zebra fiskar erhölls av prof. Omid Safari (Institutionen för fiske, fakulteten för naturresurser och miljö, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran)10. Vävnad dissektion Offra zebra fiskar genom nedsänkning i isvatten (5 delar is/1 del vatten, 4 ° c); lämna dem tills alla rörelser har upphört för att säkerställa döden genom hypoxi. Snabbt ta bort tarmen och hjärnan …

Representative Results

Representativa data för immunoperoxidasfärgning visas i figur 1 och figur 2. Immunohistokemisk analys av ox-a och OX-2R distribution i tarmen av vuxna zebra fiskar visade olika lokaliserings platser av ox-a och OX-2R och deras ökningar i uttryck i tarm cellerna i Dio zebra fiskar. En intensiv brun färgning för OX-A observerades i cellerna i den mediala och främre tarmen (figur 1a, en1). Den immunoexpression av OX-A …

Discussion

Prov beredning

Prov beredning är det första kritiska steget i IHC. Ett tillförlitligt protokoll möjliggör underhåll av Cellmorfologi, vävnads arkitektur och antigenicitet. Detta steg kräver korrekt vävnads uppsamling, fixering och snittning22,23. Syftet med fixering är att bevara vävnad och minska effekten av vävnads enzymer eller mikroorganismer. I synnerhet bevarar fixeringssteget cellulära kompon…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, University of Sannio.

Materials

Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry–the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J., Howard, G. C., Kaser, M. R. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O’Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

ImmunohistochemistryImmunoperoxidaseImmunofluorescenceZebrafishOrexinEndocannabinoid ReceptorsCryosectioningBlockingPrimary AntibodiesIncubation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Imperatore, R., D’Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image