وظيفية من القوة الذرية مجهر Cantilevers مع خلايا واحدة تي أو الجسيمات واحدة لالمناعية أحادية الخلية قوة مطيافية
Summary
نقدم بروتوكولا ً لتجسيد مجهر القوة الذرية (AFM) مع خلية T واحدة وجسيمات الخرزة للدراسات المناعية. وتظهر إجراءات التحقيق في خلية T خلية واحدة ملزمة من قبل AFM ورصد الاستجابة الخلوية في الوقت الحقيقي من الضامة إلى الجسيمات الصلبة واحدة من قبل AFM مع التصوير الفلوري.
Abstract
التحليل المجهري للقوة الذرية القائم على قوة الخلية الواحدة (AFM-SCFS) هو أداة قوية لدراسة الخصائص البيوفيزيائية للخلايا الحية. تسمح هذه التقنية للتحقق من نقاط القوة والديناميات التفاعل على غشاء الخلية الحية, بما في ذلك تلك التي بين الخلايا, مستقبلات وligands, وجنبا إلى جنب مع العديد من الاختلافات الأخرى. كما أنها تعمل كآلية لتقديم التحفيز الفيزيائي أو البيوكيميائي على الخلايا المفردة بطريقة محكومة زمنياً، مما يسمح بمراقبة تنشيط الخلايا المحددة والأحداث الخلوية اللاحقة في الوقت الحقيقي عندما يتم دمجها مع الخلية الحية التصوير الفلوري. الخطوة الرئيسية في تلك القياسات AFM-SCFS هي AFM-cantilever functionalization، أو بعبارة أخرى، إرفاق موضوع من الفائدة على cantilever. هنا، نقدم أساليب لتعديل cantilevers AFM مع خلية T واحدة وحبة البوليسترين واحدة على التوالي للدراسات المناعية. الأول ينطوي على الغراء متوافق بيولوجيا أن الأزواج خلايا T واحدة إلى غيض من cantilever شقة في حل، في حين أن هذا الأخير يعتمد على الغراء الايبوكسي لالتصاق حبة واحدة في بيئة الهواء. كما يتم توفير تطبيقين مناعيين مرتبطين بكل تعديل في الكانتيلفين. الطرق الموصوفة هنا يمكن تكييفها بسهولة لأنواع الخلايا المختلفة والجسيمات الصلبة.
Introduction
وقد وجدت مجهرية القوة الذرية (AFM)، أداةمتعددة الاستخدامات، العديد من التطبيقات في أبحاث بيولوجيا الخلايا 1،2،3،4،5. وبصرف النظر عن قدرتها على التصوير عالية الدقة، تسمح ميزة سبر القوة الأصلية بالخصائص البيوفيزيائية للخلايا الحية للتحقيق مباشرة في الموقع على مستوى الخلية الواحدة6و7. وتشمل هذه صلابة الهياكل دون الخلوية أو حتى الخلايا الكاملة8،9،10،11،12، محددة ligand / مستقبلات نقاط القوة ملزمة في مستوى جزيء واحد على سطح الخلية13، وقوات التصاق بين أزواج واحدة من الجسيمات الصلبة والخلايا أو بين خليتين1،2،14،15. وغالبا ما تصنف هذه الأخيرة على أنها مطياف قوة خلية واحدة (SCFS)16. نظرا ً للوجود اتّصاليّة متاحة بسهولة مع ثابت ة ربيعية مختلفة، فإن نطاق القوة الذي يمكن الوصول إليه من قبل AFM واسع نوعاً ما من عدد قليل من البيكونيوتن (pN) إلى ميكرونيوتن (μN)، الذي يغطي بشكل كافًا المجموعة الكاملة من الأحداث الخلوية التي تشمل قوى من بضع عشرات من pN، مثل مستقبلات القائم على واحد جزيء ملزمة، إلى nN، مثل الأحداث الخلوية phagocytic15. هذا النطاق قوة ديناميكية كبيرة يجعل AFM مفيدة على غيرها من تقنيات القوة التحقيق مثل ملاقط البصرية / المغناطيسية ومسبار قوة الغشاء الحيوي، كما أنها أكثر ملاءمة لقياسات قوة ضعيفة، مع قوة عادة أقل من 200 pN17 , 18.وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تعمل AFM كمتلاعب عالية الدقة لتقديم مختلف المحفزات على خلايا واحدة بطريقة محددة زمنيا4،19. هذا أمر مرغوب فيه لدراسات تنشيط خلية واحدة في الوقت الحقيقي. جنبا إلى جنب مع التصوير الفلورة الخلية الحية، يمكن رصد الاستجابة الخلوية اللاحقة للتحفيز محددة في وقت واحد، مما يجعل SCFS المستندة إلى AFM قوية للغاية كما التصوير البصري توفير أداة عملية للتحقيق الإشارات الخلوية. على سبيل المثال، تم استخدام AFM لتحديد السلالات اللازمة للحصول على عابرات الكالسيوم في osteoblasts20. في هذا العمل، تم تعقب عابري الكالسيوم بشكل فلوري من خلال التصوير الكالسيوم نسبة متري بعد تطبيق القوى المترجمة على osteoblasts المستزرعة مع طرف AFM. في الآونة الأخيرة، تم استخدام AFM لتمتد fibrils الكولاجين التي نمت خلايا الستيلات الكبد (HSC) وهذا التنشيط HSC التي يسببها المشانو تم رصدها في الوقت الحقيقي من قبل جهاز استشعار حيوي SRC الفلورسنت، الذي الفسفورية كما يمثلها ويرتبط كثافة الفلورة من جهاز الاستشعارالحيوي مع تفعيل HSC 3.
في تجارب SCFS المستندة إلى AFM، يعتبر إضفاء الطابع الوظيفي السليم على cantilevers AFM خطوة رئيسية نحو القياسات الناجحة. منذ اهتمامنا البحثي يركز على تنشيط الخلايا المناعية، ونحن تعمل بشكل روتيني cantilevers مع المسائل الجسيمات مثل الجسيمات الصلبة واحدة التي يمكن أن تؤدي إلى phagocytosis و / أو استجابات المناعة القوية4،14 , 15 وخلايا T واحدة التي يمكن أن تشكل متشابك المناعة مع مستضد تقديم الخلايا، مثل الخلايا الجذعية المنشطة (DC)2. وعادة ما تقترن الجسيمات الصلبة واحدة إلى cantilever عن طريق الغراء الايبوكسي في بيئة الهواء، في حين أن خلايا T واحدة، بسبب طبيعتها غير لاصقة، هي functionalized إلى cantilever عن طريق الغراء متوافق بيولوجيا في الحل. هنا، ونحن نوصف أساليب لتنفيذ هذين النوعين من تعديل cantilever وإعطاء اثنين من التطبيقات المرتبطة بها كذلك. التطبيق الأول هو التحقيق T خلية / DC التفاعلات مع AFM-SCFS لفهم الآلية القمعية للخلايا T التنظيمية من وجهة نظر ميكانيكا الخلية. والثاني ينطوي على الجمع بين AFM مع التصوير الفلوري الخلايا الحية لرصد الاستجابة الخلوية للماكروفاج إلى الجسيمات الصلبة في الوقت الحقيقي للكشف عن الآلية الجزيئية للفوسفاتيديلينسيتول مستقل مستقبلات 4,5-بيسفوسفات (PIP2)- [موسين] يتوسط [فغوستسس]. والهدف من هذا البروتوكول هو توفير إطار مرجعي للباحثين المهتمين لتصميم وتنفيذ الإعدادات التجريبية الخاصة بهم مع تحليل الخلايا الواحدة القائم على AFM للبحوث المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تطور التحليل الطيفي لقوة الخلية الواحدة القائم على AFM ليكون أداة قوية لمعالجة الخصائص الفيزيائية الحيوية للخلايا الحية. وبالنسبة لتلك التطبيقات، تحتاج العلبة إلى أن تعمل بشكل صحيح من أجل سبر تفاعلات أو خصائص محددة على خلايا الاهتمام. هنا، يتم وصف أساليب لاقتران خلية T واحدة وحبة واحدة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31370878)، وبرنامج مفتاح الدولة (31630023)، وبرنامج مجموعة البحوث المبتكرة (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
References
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) – a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
