Functionalization dos Cantialavancos do microscópio da força atômica com únicas-células de T ou único-partícula para a espectroscopia imunológica da força da único-pilha
Summary
Nós apresentamos um protocolo para funcionalizar cantialavancas do microscópio de força atômica (AFM) com uma única pilha de T e partícula do grânulo para estudos imunológicos. Os procedimentos para sondar a ligação Cell-dendritic do único-par célula T por AFM e monitorar a resposta celular em tempo real dos macrófagos a uma única partícula contínua pelo AFM com imagem latente da fluorescência são mostrados.
Abstract
A microscopia de força atômica baseou a espectroscopia da força da única pilha (AFM-SCFS) é uma ferramenta poderosa para estudar Propriedades biofísicas de pilhas vivas. Esta técnica permite a sondagem de pontos fortes e dinâmicas de interação em uma membrana celular viva, incluindo aquelas entre células, receptores e ligantes, e ao lado de muitas outras variações. Igualmente trabalha como um mecanismo para entregar um estímulo físico ou bioquímico em únicas pilhas em uma maneira spatiotemporally controlada, assim permitindo a ativação específica da pilha e os eventos celulares subseqüentes a ser monitorados no tempo real quando combinados com a viver-pilha imagem latente da fluorescência. O passo chave nessas medições AFM-SCFS é a funcionalização do AFM-cantilever, ou seja, anexar um assunto de interesse ao cantilever. Aqui, nós apresentamos métodos para modificar cantialavancas de AFM com uma única pilha de T e um único grânulo do poliestireno respectivamente para estudos imunológicos. O primeiro envolve uma colagem biocompatível que acopla únicas pilhas de T à ponta de um cantilever liso em uma solução, quando o último depender em uma colagem da cola Epoxy para a única aderência do grânulo no ambiente do ar. Duas aplicações imunológicas associadas a cada modificação do cantilever são fornecidas também. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados a diferentes tipos de células e partículas sólidas.
Introduction
A microscopia da força atômica (AFM), uma ferramenta versátil, encontrou muitas aplicações na pesquisa da biologia da pilha1,2,3,4,5. Aparte de sua capacidade de imagem latente de alta resolução, a característica da força-sondagem nativa permite que as propriedades biofísicas de pilhas vivas sejam investigadas diretamente in situ no nível da único-pilha6,7. Estes incluem a rigidez de estruturas subcelulares ou mesmo células inteiras8,9,10,11,12, ligante específico/receptor de forças de ligação no nível de molécula única na superfície celular13, e forças de aderência entre pares de partículas sólidas e células ou entre duas células1,2,14,15. Os dois últimos são frequentemente categorizados como espectroscopia de força de célula única (SCFS)16. Devido aos cantialavancos prontamente disponíveis com vária mola constante, a escala da força acessível a AFM é rather larga de alguns piconewtons (pN) aos micronewtons (μN), que cobre adequadamente a escala inteira de eventos celulares que envolvem forças de algumas dezenas de pN, como ligação de molécula única baseada em receptores, a nN, como eventos celulares fagocíticos15. Esta grande escala dinâmica da força faz AFM vantajoso sobre outras técnicas da forçar-sondagem tais como pinças óticos/magnéticos e uma ponta de prova da força do biomembrana, porque são mais apropriadas para medidas da fraco-força, com força tipicamente menos do que 200 PN17 , 18. Além disso, AFM pode funcionar como um manipulador de alta precisão para entregar vários estímulos em células individuais em uma forma espaciotemporalmente definida4,19. Isso é desejável para os estudos de ativação de célula única em tempo real. Combinada com a imagem latente da fluorescência da vivo-pilha, a resposta celular subseqüente ao estímulo específico pode ser monitorada simultaneamente, assim fazendo o SCFS AFM-baseado excessivamente robusto como a imagem latente ótica que fornece uma ferramenta prática para sondar a sinalização celular. Por exemplo, AFM foi utilizado para determinar as cepas necessárias para provocar transientes de cálcio em osteoblastos20. Neste trabalho, os transientes do cálcio foram controlados cDNAs com a imagem latente ratiométrica do cálcio após a aplicação de forças localizadas em osteoblastos cultivados com uma ponta de AFM. Recentemente, AFM foi empregado para esticar as fibrilas do colagénio em que as pilhas stellate hepatic (HSC) estiveram crescidas e esta ativação mechano-transaculada de HSC era tempo real monitorado por um biosensor fluorescente do src, cuja o fosforilação como representado pelo a intensidade da fluorescência do biosensor é correlacionada com a ativação de HSC3.
Em experimentos SCFS baseados em AFM, a funcionalização adequada de cantimanhas AFM é um passo fundamental para medições bem-sucedidas. Desde que nosso interesse da pesquisa centra-se sobre a ativação das pilhas imunes, nós funcionamos rotineiramente cantialavancas com matérias particuladas tais como únicas partículas contínuas que podem provocar o fagocitose e/ou respostas imunes fortes4,14 , 15 e células T únicas que podem formar uma sinapse imune com células apresentadoras de antígeno, como células dendríticas ativadas (DC)2. As únicas partículas contínuas são acopladas normalmente a um cantilever através de uma colagem da cola Epoxy no ambiente do ar, visto que as únicas pilhas de T, devido a sua natureza não-adesiva, são funcionalizadas a um cantilever através de uma colagem biocompatível na solução. Aqui, descrevemos os métodos para executar esses dois tipos de modificação cantilever e dar duas aplicações associadas também. A primeira aplicação é sondar interações de T Cell/DC com AFM-SCFS para compreender o mecanismo supressor de células T reguladoras do ponto de vista da mecânica celular. O segundo envolve a combinação de AFM com a imagem latente da fluorescência da vivo-pilha para monitorar a resposta celular do macrófago a uma partícula contínua no tempo real para revelar o mecanismo molecular do fosfatidilinositol receptor-independente 4, 5-bisphosphate (PIP2)- Moesin mediou a fagocitose. O objetivo deste protocolo é fornecer um quadro de referência para que pesquisadores interessados projetem e implementem seus próprios parâmetros experimentais com análise de células simples baseadas em AFM para pesquisa imunológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
A espectroscopia da força da único-pilha baseada em AFM evoluiu para ser uma ferramenta poderosa para endereçar as propriedades biofísicas de pilhas vivas. Para essas aplicações, o cantilever precisa ser funcionalizada corretamente, a fim de sondar interações específicas ou propriedades sobre as células de interesse. Aqui, os métodos para acoplando a única pilha de T e a única grânulo Micron-feitos medida ao modilhão Tip-less são descritos respectivamente. Para prender uma única pilha de T ao cantilever,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais do programa geral da China (31370878), programa de chave estatal (31630023) e programa de grupo de pesquisa inovadora (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
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