免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化
Summary
我々は、免疫学的研究のための単一のT細胞およびビーズ粒子を用いて原子間力顕微鏡(AFM)片持ちを機能化するプロトコルを提示する。AFMによる単一対T細胞樹状細胞結合をプローブし、蛍光イメージングを用いてAFMによる単一固体粒子に対するマクロファージのリアルタイム細胞応答を監視する手順が示されている。
Abstract
原子力顕微鏡ベースの単一細胞力分光法(AFM-SCFS)は、生細胞の生物物理学的特性を研究するための強力なツールです。この技術は、細胞、受容体およびリガンド間の相互作用の強さとダイナミクスを、他の多くのバリエーションと共に調知することを可能にする。また、単一細胞に対して物理的または生化学的刺激を時空間的に制御した方法で送り出すメカニズムとしても機能し、生細胞と組み合わせると、特定の細胞活性化とその後の細胞イベントをリアルタイムで監視することができます。蛍光イメージング。これらのAFM-SCFS測定の重要なステップは、AFM片持ち機能化、つまり、目的の対象を片持ちに取り付けることです。ここでは、免疫学的研究のために、単一のT細胞と単一のポリスチレンビーズでAFM片持ちを修飾する方法を紹介する。前者は、溶液中の平らな片持ちの先端に単一のT細胞を結合する生体適合性の接着剤を含み、後者は空気環境における単一ビーズ接着のためのエポキシ接着剤に依存する。各片持ち修正に関連する2つの免疫学的応用も同様に提供される。ここで説明する方法は、異なる細胞タイプおよび固体粒子に容易に適合させることができる。
Introduction
原子力顕微鏡(AFM)、汎用性の高いツールは、細胞生物学研究1、2、3、4、5で多くの応用を発見しました。その高解像度イメージング機能とは別に、ネイティブ力プローブ機能により、生細胞の生物物理学的特性を単一細胞レベル6、7の現場で直接調べることができる。これらには、細胞内構造または細胞全体の剛性8、9、10、11、12、特異的リガンド/受容体結合強度が含まれる。細胞表面上の単一分子レベル13は、固体粒子と細胞の単一対間または2つの細胞間の接着力1、2、14、15。後者の2つは、多くの場合、単一細胞力分光法(SCFS)16として分類される。様々なばね定数を持つ容易に利用可能な片持ちのために、AFMにアクセス可能な力範囲は、数十からの力を含む細胞イベントの全範囲を十分にカバーするいくつかのピコニュートン(pN)からマイクロニュートン(μN)までかなり広いです。受容体ベースの単一分子結合などのpNの、nNへの、例えば、咽頭細胞イベント15。この大きなダイナミックフォースレンジは、光学/磁気ピンセットやバイオ膜力プローブなどの他の力プローブ技術に比べてAFMに有利であり、弱力測定に適しており、通常は200 pN17未満の力を持ちます。,18.さらに、AFMは、時空間的に定義された方法で単一細胞に様々な刺激を提供する高精度マニピュレータとして機能することができます 4,19.これは、リアルタイム単一細胞活性化研究に望ましい。生細胞蛍光イメージングと組み合わせることで、特定の刺激に対するその後の細胞応答を同時に監視できるため、AFMベースのSCFSは光学イメージングとして非常に堅牢になり、細胞シグナル伝達をプローブする実用的なツールを提供します。例えば、AFMは、骨芽細胞20でカルシウム過渡を引き出すために必要な株を決定するために使用された。本研究では、AFM先端を用いた培養骨芽細胞への局所的な力の適用後、カルシウム過渡性画像を用いてカルシウム過渡を蛍光で追跡した。最近では、肝系ステラー細胞(HSC)が増殖したコラーゲン線維化を伸縮するためにAFMが採用され、このメカノ変換HSC活性化は蛍光Srcバイオセンサによってリアルタイムモニタリングされ、そのリン酸化物は、バイオセンサの蛍光強度は、HSC活性化3と相関している。
AFMベースのSCFS実験では、AFM片持ち式の適切な機能化が測定の成功に向けた重要なステップです。私たちの研究の関心は免疫細胞の活性化に焦点を当てているので、我々は定期的に食細胞症や強力な免疫応答を引き起こす可能性のある単一固体粒子などの粒子状物質を持つ片持ちを機能化 4,14,活性化樹状細胞(DC)2などの抗原提示細胞を有する免疫シナプスを形成できる15および単一T細胞。 単一固体粒子は、通常、空気中のエポキシ接着剤を介して片持ちに結合されますが、単一のT細胞は、その非粘着性の性質のために、溶液中の生体適合性接着剤を介して片持ちに機能化されます。ここでは、これら2種類の片持ち修正を行い、2つの関連するアプリケーションを提供する方法について説明する。最初の応用は、AFM-SCFSとのT細胞/DC相互作用をプローブし、細胞力学の観点から制御T細胞の抑制機構を理解することです。2つ目は、AFMと生細胞蛍光イメージングを組み合わせて、受容体非依存ホスファチリノシトール4,5-ビスリン酸(PIP2)の分子機構を明らかにするために、固体粒子に対するマクロファージの細胞応答をリアルタイムで監視することを含む。モエシンは、咽頭細胞症を媒介した。このプロトコルの目的は、興味を持つ研究者が免疫学的研究のためのAFMベースの単一細胞分析を用いて独自の実験設定を設計し、実装するための参照フレームワークを提供することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
AFMベースの単細胞力分光法は、生細胞の生体物理学的特性に対処するための強力なツールとして進化してきました。これらのアプリケーションでは、目的の細胞上の特定の相互作用または特性をプローブするために、片持ちは適切に機能化する必要があります。ここで、単一T細胞と単一ミクロンサイズのビーズを先端のない片持ち先に結合する方法についてそれぞれ説明する。片持ち式に単…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(31370878)、国家キープログラム(31630023)、革新的研究グループプログラム(81621002)によって支援されています。
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
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