Funcionalización de voladizos de microscopio de fuerza atómica con células de una t o de una sola partícula para espectroscopia de fuerza de una sola célula inmunológica
Summary
Presentamos un protocolo para funcionalizar los voladizos del microscopio de fuerza atómica (AFM) con una sola célula T y partícula de cuentas para estudios inmunológicos. Se muestran los procedimientos para sondear la unión de células T de un solo par por AFM y para monitorear la respuesta celular en tiempo real de los macrófagos a una sola partícula sólida por AFM con imágenes de fluorescencia.
Abstract
La espectroscopia de fuerza de célulaúnica basada en microscopía de fuerza atómica (AFM-SCFS) es una poderosa herramienta para estudiar las propiedades biofísicas de las células vivas. Esta técnica permite sondear las fuerzas de interacción y la dinámica en una membrana celular viva, incluyendo aquellos entre las células, receptor y ligandos, y junto con muchas otras variaciones. También funciona como un mecanismo para entregar un estímulo físico o bioquímico en células individuales de una manera controlada espaciotemporalmente, permitiendo así la activación celular específica y los eventos celulares subsiguientes para ser monitoreadoen en tiempo real cuando se combina con células vivas fluorescencia. El paso clave en esas mediciones AFM-SCFS es la funcionalización AFM-cantilever, o en otras palabras, adjuntar un sujeto de interés al voladizo. Aquí, presentamos métodos para modificar los voladizos AFM con una sola célula T y un solo cordón de poliestireno respectivamente para estudios inmunológicos. El primero implica un pegamento biocompatible que acopla células T individuales a la punta de un voladizo plano en una solución, mientras que el segundo se basa en un pegamento epoxi para la adhesión de un solo cordón en el ambiente del aire. También se proporcionan dos aplicaciones inmunológicas asociadas con cada modificación en voladizo. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar fácilmente a diferentes tipos de células y partículas sólidas.
Introduction
La microscopía de fuerza atómica (AFM), una herramienta versátil, ha encontrado muchas aplicaciones en la investigación de biología celular1,2,3,4,5. Aparte de su capacidad de imagen de alta resolución, la función nativa de sondeo de fuerza permite investigar directamente las propiedades biofísicas de las células vivas in situ en el nivel6deuna sola célula,7. Estas incluyen las rigideces de las estructuras subcelulares o incluso células enteras8,9,10,11,12, ligando /receptor específico nivel de molécula única en la superficie celular13, y fuerzas de adhesión entre pares únicos de partículas sólidas y células o entre dos células1,2,14,15. Estos dos últimos se clasifican a menudo como espectroscopía de fuerza de una sola célula (SCFS)16. Debido a los voladizos fácilmente disponibles con varias constantes de resorte, el rango de fuerza accesible para AFM es bastante amplio desde unos piconewtons (pN) hasta micronewtons (N), que cubre adecuadamente toda la gama de eventos celulares que involucran fuerzas de unas pocas decenas de pN, como la unión de una sola molécula basada en receptores, a nN, como los eventos celulares fagocíticos15. Este gran rango de fuerza dinámica hace que el AFM sea ventajoso sobre otras técnicas de sondeo de fuerza, como pinzas ópticas/magnéticas y una sonda de fuerza de biomembrana, ya que son más adecuados para mediciones de fuerza débil, con una fuerza típicamente inferior a 200 pN17 , 18. Además, AFM puede funcionar como un manipulador de alta precisión para entregar varios estímulos en células individuales de una manera espaciotemporalmente definida4,19. Esto es deseable para los estudios de activación de una sola célula en tiempo real. En combinación con las imágenes de fluorescencia de células vivas, la respuesta celular posterior al estímulo específico se puede monitorear simultáneamente, haciendo que el SCFS basado en AFM sea extremadamente robusto como imágenes ópticas que proporcionan una herramienta práctica para sondear la señalización celular. Por ejemplo, AFM se utilizó para determinar las cepas necesarias para obtener transitorios de calcio en osteoblastos20. En este trabajo, los transitorios de calcio fueron rastreados fluorescentemente a través de imágenes métricas de relación de calcio después de la aplicación de fuerzas localizadas en osteoblastos cultivados con una punta de AFM. Recientemente, se empleó AFM para estirar fibrillas de colágeno en las que se cultivaban células estelares hepáticas (HSC) y esta activación de HSC transducida por mecano fue monitoreada en tiempo real por un biosensor fluorescente Src, cuya fosforilación representada por el la intensidad de la fluorescencia del biosensor está correlacionada con la activación de HSC3.
En los experimentos SCFS basados en AFM, la funcionalización adecuada de los voladizos AFM es un paso clave hacia mediciones exitosas. Dado que nuestro interés en la investigación se centra en la activación de las células inmunitarias, funcionalizamos rutinariamente losvoladizos con partículas, como partículas sólidas individuales que pueden desencadenar fagocitosis y/o respuestas inmunitarias fuertes 4,14 , 15 y células T únicas que pueden formar una sinapsis inmune con células que presentan antígeno, como células dendríticas activadas (DC)2. Las partículas sólidas individuales normalmente se acoplan a un voladizo a través de un pegamento epoxi en el entorno del aire, mientras que las células T individuales, debido a su naturaleza no adhesiva, se funcionalizan a un voladizo a través de un pegamento biocompatible en solución. Aquí, describimos los métodos para realizar estos dos tipos de modificación en voladizo y dar dos aplicaciones asociadas también. La primera aplicación es sondear las interacciones de células T/DC con AFM-SCFS para comprender el mecanismo supresor de las células T reguladoras desde el punto de vista de la mecánica celular. El segundo consiste en combinar AFM con imágenes de fluorescencia de células vivas para monitorear la respuesta celular de macrófagos a una partícula sólida en tiempo real para revelar el mecanismo molecular de fosfatidilinositol independiente del receptor 4,5-bisfosfato (PIP2)- La moesina mediaba en la fagocitosis. El objetivo de este protocolo es proporcionar un marco de referencia para que los investigadores interesados diseñen e implementen sus propios entornos experimentales con análisis de una sola célula basados en AFM para la investigación inmunológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La espectroscopia de fuerza de una sola célula basada en AFM ha evolucionado hasta convertirse en una poderosa herramienta para abordar las propiedades biofísicas de las células vivas. Para esas aplicaciones, el voladizo debe ser funcionalizado correctamente con el fin de sondear interacciones específicas o propiedades en las celdas de interés. Aquí, se describen los métodos para acoplar una sola célula T y un solo micronés a la voladizo sin punta, respectivamente. Para fijar una sola célula T al voladizo, se e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo del Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31370878), el Programa Clave del Estado (31630023) y el Programa de Grupos de Investigación Innovadora (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
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