Fonctionnalisation des cantilevers de microscope de force atomique avec des cellules simples-T ou une seule particule pour la spectroscopie immunologique de force unicellulaire
Summary
Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser le microscope de force atomique (AFM) cantilevers avec une seule cellule T et particule de perle pour des études immunologiques. Des procédures pour sonder la liaison de cellule T-dendritic à paire simple par AFM et pour surveiller la réponse cellulaire en temps réel des macrophages à une seule particule solide par AFM avec la formation image de fluorescence sont montrées.
Abstract
La spectroscopie à force atomique à base de force monocellulaire (AFM-SCFS) est un outil puissant pour étudier les propriétés biophysiques des cellules vivantes. Cette technique permet de sonder les forces d’interaction et la dynamique sur une membrane cellulaire vivante, y compris celles entre les cellules, les récepteurs et les ligands, et aux côtés de nombreuses autres variations. Il fonctionne également comme un mécanisme pour fournir un stimulus physique ou biochimique sur les cellules simples d’une manière spatiotemporellement contrôlée, permettant ainsi l’activation cellulaire spécifique et les événements cellulaires suivants à surveiller en temps réel lorsqu’il est combiné avec la cellule vivante l’imagerie par fluorescence. L’étape clé de ces mesures AFM-SCFS est la fonctionnalisation en porte-à-faux AFM, ou en d’autres termes, l’attachement d’un sujet d’intérêt au porte-à-faux. Ici, nous présentons des méthodes pour modifier des cantilevers d’AFM avec une seule cellule T et une perle de polystyrène simple respectivement pour des études immunologiques. Le premier implique une colle biocompatible qui associe les lymphocytes T simples à la pointe d’un porte-à-faux plat dans une solution, tandis que le second s’appuie sur une colle époxy pour l’adhérence à perles simples dans l’environnement de l’air. Deux applications immunologiques associées à chaque modification de porte-à-faux sont également fournies. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptées à différents types de cellules et de particules solides.
Introduction
La microscopie de force atomique (AFM), un outil polyvalent, a trouvé de nombreuses applications dans la recherche en biologie cellulaire1,2,3,4,5. Outre sa capacité d’imagerie à haute résolution, la fonction de recherche de force native permet d’étudier directement in situ les propriétés biophysiques des cellules vivantes au niveau unicellulaire6,7. Il s’agit notamment des rigidités des structures subcellulaires ou même des cellules entières8,9,10,11,12, des forces spécifiques de liaison ligand/récepteur à la niveau d’une seule molécule sur la surface cellulaire13, et les forces d’adhérence entre les paires simples de particules solides et les cellules ou entre deux cellules1,2,14,15. Ces deux derniers sont souvent classés comme spectroscopie de force unicellulaire (SCFS)16. En raison des cantilevers facilement disponibles avec diverses constantes de ressort, la gamme de force accessible à l’AFM est assez large de quelques piconewtons (pN) aux micronewtons (N), qui couvre adéquatement toute la gamme des événements cellulaires impliquant des forces de quelques dizaines de pN, comme la liaison à base de récepteurs à une seule molécule, à nN, tels que les événements cellulaires phagocytiques15. Cette grande plage de force dynamique rend l’AFM avantageux par-dessus d’autres techniques de recherche de force telles que les pinces optiques/magnétiques et une sonde de force de biomembrane, car elles sont plus appropriées pour des mesures de force faible, avec la force typiquement inférieure à 200 pN17 , 18. En outre, l’AFM peut fonctionner comme un manipulateur de haute précision pour délivrer divers stimuli sur des cellules simples d’une manière spatiotemporellement définie4,19. Ceci est souhaitable pour les études d’activation unicellulaire en temps réel. Combinée à l’imagerie par fluorescence des cellules vivantes, la réponse cellulaire subséquente au stimulus spécifique peut être surveillée simultanément, ce qui rend le SCFS à base d’AFM extrêmement robuste comme imagerie optique fournissant un outil pratique pour sonder la signalisation cellulaire. Par exemple, l’AFM a été utilisée pour déterminer les souches nécessaires pour obtenir des transitoires de calcium dans les ostéoblastes20. Dans ce travail, les transitoires de calcium ont été suivis fluorescentpar par l’imagerie ratiométrique de calcium après l’application des forces localisées sur les ostéoblastes cultivés avec une pointe d’AFM. Récemment, l’AFM a été employée à étirer des fibrilles de collagène sur lesquelles les cellules stellates hépatiques (HSC) ont été cultivées et cette activation mécano-transduced de HSC a été en temps réel surveillée par un biocapteur fluorescent src, dont la phosphorylation telle que représentée par le l’intensité de fluorescence du biocapteur estcorrélée avec l’activation de HSC 3.
Dans les expériences SCFS basées sur l’AFM, la bonne fonctionnalisation des cantilevers AFM est une étape clé vers des mesures réussies. Puisque notre intérêt de recherche se concentre sur l’activation des cellules immunitaires, nous fonctionnions systématiquement les cantilevers avec des matières particulaires telles que les particules solides simples qui peuvent déclencher la phagocytose et/ou les réponses immunitaires fortes4,14 , 15 et les lymphocytes T simples qui peuvent former une synapse immunitaire avec des cellules présentant des antigènes, telles que les cellules dendritiques activées (DC)2. Les particules solides simples sont normalement couplées à un porte-à-faux via une colle époxy dans l’environnement de l’air, tandis que les lymphocytes T simples, en raison de leur nature non-adhésive, sont fonctionnalisés à un porte-à-faux via une colle biocompatible en solution. Ici, nous décrivons les méthodes pour effectuer ces deux types de modification de porte-à-faux et donnons deux applications associées aussi bien. La première application consiste à sonder les interactions lymphocytes T/DC avec L’AFM-SCFS pour comprendre le mécanisme suppressif des lymphocytes T régulateurs du point de vue de la mécanique cellulaire. La deuxième consiste à combiner l’AFM avec l’imagerie par fluorescence des cellules vivantes pour surveiller la réponse cellulaire du macrophage à une particule solide en temps réel pour révéler le mécanisme moléculaire du phosphatidylinositol indépendant des récepteurs 4,5-bisphosphate (PIP2)- Moesin a médiatisé la phagocytose. L’objectif de ce protocole est de fournir un cadre de référence pour les chercheurs intéressés à concevoir et à mettre en œuvre leurs propres paramètres expérimentaux avec l’analyse à base d’AFM à une seule cellule pour la recherche immunologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
La spectroscopie à force unicellulaire à base d’AFM a évolué pour devenir un outil puissant pour aborder les propriétés biophysiques des cellules vivantes. Pour ces applications, le porte-à-faux doit être fonctionnalisé correctement afin de sonder des interactions ou des propriétés spécifiques sur les cellules d’intérêt. Ici, les méthodes pour coucoupler la cellule T simple et la perle de micron simple-classée au porte-à-faux tip-less sont décrites respectivement. Pour attacher une seule cellule T au po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux sont appuyés par le National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), le State Key Program (31630023) et le Innovative Research Group Program (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
References
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