Funktionalisering af atomkraften mikroskop Cantihåndtag med enkelt-T-celler eller enkelt-partikel for immunologisk enkelt celle kraft spektroskopi
Summary
Vi præsenterer en protokol til funktionalisere atomkraften mikroskop (AFM) cantihåndtag med en enkelt T-celle og perle partikel for immunologiske undersøgelser. Der vises procedurer til sonde af enkeltpar T-celle-dendritisk cellebinding med AFM og overvågning af makro Fages realtids cellulære respons på en enkelt fast partikel ved AFM med fluorescens dannelse.
Abstract
Atomkraften mikroskopi baseret enkelt celle Force spektroskopi (AFM-SCFS) er et kraftfuldt værktøj til at studere biofysiske egenskaber af levende celler. Denne teknik giver mulighed for sondering interaktion styrker og dynamik på en levende celle membran, herunder dem mellem celler, receptor og ligands, og sammen med mange andre variationer. Det fungerer også som en mekanisme til at levere en fysisk eller biokemisk stimulus på enkeltceller i en spatialt kontrolleret måde, således at specifikke celle aktivering og efterfølgende cellulære hændelser, der skal overvåges i realtid, når det kombineres med levende celle Fluorescens Imaging. Det vigtigste skridt i disse AFM-SCFS målinger er AFM-cantilever funktionalisering, eller med andre ord, vedhæfte et emne af interesse for cantilever. Her præsenterer vi metoder til at ændre AFM cantihåndtag med en enkelt T-celle og en enkelt polystyren perle henholdsvis for immunologiske undersøgelser. Førstnævnte involverer en biokompatibel lim, der par enkelt T-celler til spidsen af en flad cantilever i en opløsning, mens sidstnævnte er afhængig af en epoxy lim til enkelt perle vedhæftning i luftmiljøet. Der gives også to immunologiske anvendelser i forbindelse med hver cantilever modifikation. De metoder, der beskrives her, kan let tilpasses forskellige celletyper og faste partikler.
Introduction
Atomic Force mikroskopi (AFM), et alsidigt værktøj, har fundet mange anvendelser i cellebiologi forskning1,2,3,4,5. Bortset fra sin høj opløsning billeddannelse kapacitet, den indfødte kraft-probing funktion tillader biofysiske egenskaber af levende celler, der skal undersøges direkte in situ på en enkelt celleniveau6,7. Disse omfatter rigiditeter af subcellulære strukturer eller endda hele celler8,9,10,11,12, specifikke ligand/receptor bindende styrker på enkelt-molekyle niveau på cellen overflade13, og vedhæftnings kræfter mellem enkelt par af faste partikler og celler eller mellem to celler1,2,14,15. De sidstnævnte to er ofte kategoriseret som single-celle Force spektroskopi (SCFS)16. På grund af de let tilgængelige CDer-håndtag med forskellige fjederkonstant, er det kraftområde, der er tilgængeligt for AFM, temmelig bredt fra nogle få piconewtons (pN) til micronewtons (μN), som dækker hele spektret af cellulære hændelser, der involverer kræfter fra nogle få TENS af pN, såsom receptor-baseret enkelt-molekyle binding, til nN, såsom fagocytiske cellulære hændelser15. Dette store dynamiske kraftområde gør AFM fordelagtig i forhold til andre kraft-probing teknikker såsom optiske/magnetiske pincetter og en biomembrane Force Probe, da de er mere velegnede til svag-kraft målinger, med kraft typisk mindre end 200 pN17 , 18. Desuden kan AFM fungere som en højpræcisions manipulator til at levere forskellige stimuli på enkeltceller på en spatialt defineret måde4,19. Dette er ønskeligt for real-time enkelt celle aktivering undersøgelser. Kombineret med levende celle fluorescens Imaging, den efterfølgende cellulære respons på den specifikke stimulus kan overvåges samtidigt, således at AFM-baserede SCFS ekstremt robust som optisk billeddannelse giver et praktisk værktøj til at sonde cellulære signalering. For eksempel blev AFM anvendt til at bestemme de stammer, der kræves for at fremkalde calcium transienter i osteoblaster20. I dette arbejde, calcium transienter blev sporet fluorescently gennem calcium ratiometrisk billeddannelse efter anvendelse af lokaliserede kræfter på dyrkede osteoblaster med en AFM spids. For nylig blev AFM ansat til at strække kollagen fibriller, hvor der blev dyrket hepatiske stellate celler (HSC), og denne mekaniserede HSC-aktivering var i realtid overvåget af en fluorescerende src-biosensor, hvis fosforylering som repræsenteret ved biosensors fluorescens intensitet er korreleret med HSC-aktivering3.
I AFM-baserede SCFS-eksperimenter er korrekt funktionalisering af AFM-cantihåndtag et vigtigt skridt mod vellykkede målinger. Da vores forskning interesse fokuserer på immunceller aktivering, vi rutinemæssigt funktionalisere cantihåndtag med partikler spørgsmål såsom enkelt faste partikler, der kan udløse fagocytose og/eller stærke immunresponser4,14 , 15 og enkelt T-celler, der kan danne en immun synapse med antigen præsenterer celler, såsom aktiverede dendritiske celler (DC)2. Enkelt faste partikler kobles normalt til en cantilever via en epoxy lim i luftmiljøet, hvorimod enkelt-T-celler på grund af deres ikke-klæbende natur er funktionaliseret til en cantilever via en biokompatibel lim i opløsning. Her beskriver vi metoderne til at udføre disse to typer af cantilever modifikation og giver to tilknyttede applikationer samt. Den første applikation er at sonde T celle/DC interaktioner med AFM-SCFS at forstå den suppressiv mekanisme af regulerende T-celler fra cellen mekanik synspunkt. Den anden involverer at kombinere AFM med levende celle fluorescens Imaging for at overvåge makrofags cellulære respons på en solid partikel i realtid for at afsløre den molekylære mekanisme af receptor uafhængig phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2)- Moesin medieret fagocytose. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en referenceramme for interesserede forskere til at udforme og gennemføre deres egne forsøgsmiljøer med AFM-baseret enkelt celle analyse for immunologisk forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM-baseret enkelt celle kraft spektroskopi har udviklet sig til at være et kraftfuldt værktøj til at løse de biofysiske egenskaber af levende celler. For disse applikationer, den cantilever skal funktionaliseret korrekt for at sonde specifikke interaktioner eller egenskaber på cellerne af interesse. Her beskrives metoderne til kobling af enkelt T-celle og enkelt micron-størrelse perler til spidsen-mindre cantilever. For at vedhæfte en enkelt T-celle til cantilever, blev en biokompatibel lim valgt som celle klæbe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er understøttet af National Natural Science Foundation i China General program (31370878), State Key program (31630023) og innovativt forskergruppe program (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
References
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) – a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
