एकल-टी सेल या इम्यूनोलॉजिकल सिंगल-सेल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए सिंगल-पार्टिकल के साथ परमाणु बल माइक्रोस्कोप कैनटाइलवर्स का कार्यात्मककरण
Summary
हम एक एकल टी सेल और प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए मनका कण के साथ परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) cantilevers functionalize करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। AFM द्वारा एकल जोड़ी टी सेल-डेन्ड्रिटिक सेल बाइंडिंग की जांच करने के लिए और फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ एएफएम द्वारा एक ठोस कण के लिए मैक्रोफेज की वास्तविक समय सेलुलर प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए प्रक्रियाओं दिखाए जाते हैं।
Abstract
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी आधारित एकल सेल बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (AFM-SCFS) जीवित कोशिकाओं के biophysical गुणों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. इस तकनीक एक जीवित कोशिका झिल्ली पर बातचीत ताकत और गतिशीलता की जांच के लिए अनुमति देता है, कोशिकाओं के बीच उन सहित, रिसेप्टर और ligands, और कई अन्य विविधताओं के साथ. यह भी एक spatiotempoly नियंत्रित तरीके से एकल कोशिकाओं पर एक भौतिक या जैव रासायनिक उत्तेजना देने के लिए एक तंत्र के रूप में काम करता है, इस प्रकार विशिष्ट सेल सक्रियण और बाद में सेलुलर घटनाओं वास्तविक समय में नजर रखी जा करने की अनुमति जब लाइव सेल के साथ संयुक्त प्रतिदीप् ति इमेजिंग. उन AFM-SCFS माप में महत्वपूर्ण कदम AFM-cantilver functionalization है, या दूसरे शब्दों में, cantilever के लिए ब्याज का एक विषय संलग्न. यहाँ, हम प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए क्रमशः एक टी सेल और एक एकल polystyrene मनका के साथ AFM cantilevers को संशोधित करने के लिए तरीकों मौजूद है. पूर्व एक bioसंगत गोंद है कि जोड़ों एक समाधान में एक फ्लैट cantilver की नोक करने के लिए एकल टी कोशिकाओं शामिल है, जबकि बाद हवा के वातावरण में एकल मनका आसंजन के लिए एक epoxy गोंद पर निर्भर करता है. दो प्रतिरक्षा अनुप्रयोगों प्रत्येक cantilver संशोधन के साथ जुड़े के रूप में अच्छी तरह से प्रदान की जाती हैं. यहाँ वर्णित विधियों को आसानी से विभिन्न प्रकार के सेल और ठोस कणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम), एक बहुमुखी उपकरण, सेल जीव विज्ञान अनुसंधान1,2,3,4,5में कई अनुप्रयोगों पाया गया है। इसकी उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग क्षमता के अलावा, मूल बल-प्रस्तावित सुविधा जीवित कोशिकाओं के जैवभौतिक गुणों की एकल-कोशिका स्तर6,7पर सीधे सिटू में जांच करने की अनुमति देती है। इनमें उपकोशिकीय संरचनाओं या यहां तक कि पूरी कोशिकाओं की कठोरता8,9,10,11,12, विशिष्ट लिगन्ड/ कोशिका पृष्ठ13पर एकल अणु स्तर तथा आसंजन बल ठोस कणों तथाकोशिकाओं के एकल-युग्मों के बीच अथवा दो कोशिकाओं 1,2,14,15के बीच होते हैं। बाद के दो अक्सर एकल कोशिका बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं (SCFS)16. विभिन्न वसंत निरंतर के साथ आसानी से उपलब्ध cantilevers के कारण, AFM के लिए सुलभ बल रेंज बल्कि कुछ piconewtons से व्यापक है (pN) micronewtons के लिए ($N), जो पर्याप्त रूप से सेलुलर कुछ दसियों से बलों को शामिल घटनाओं की पूरी रेंज को शामिल किया गया पीएएन की, जैसे रिसेप्टर-आधारित एकल-अणु बंधन, एन एन के लिए, जैसे कि फैगोसाइटिक सेलुलर इवेंट15। इस बड़े गतिशील बल रेंज AFM ऑप्टिकल / चुंबकीय चिमटी और एक biomembrane बल जांच के रूप में अन्य बल-प्रोबेक्ट तकनीकों पर फायदेमंद बनाता है, के रूप में वे कमजोर बल माप के लिए अधिक उपयुक्त हैं, बल के साथ आम तौर पर कम से कम 200 pN17 , 18. इसके अतिरिक्त , एएफएम एक उच्च परिशुद्धता हेरफेर के रूप में कार्य कर सकता है ताकि एकल कोशिकाओं पर विभिन्न उत्तेजनाओं को एक spatiotempoly परिभाषित तरीके से4,19में वितरित किया जा सके . यह वास्तविक समय एकल सेल सक्रियण अध्ययन के लिए वांछनीय है. लाइव-सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ संयुक्त, विशिष्ट उत्तेजना के लिए बाद में सेलुलर प्रतिक्रिया समवर्ती नजर रखी जा सकती है, इस प्रकार AFM आधारित SCFS बेहद मजबूत बनाने के रूप में ऑप्टिकल इमेजिंग सेलुलर संकेतन की जांच करने के लिए एक व्यावहारिक उपकरण प्रदान. उदाहरण के लिए, एएफएम का उपयोग ऑस्टियोब्लास्ट्स20में कैल्शियम के क्षणिकों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक उपभेदों को निर्धारित करने के लिए किया गया था। इस काम में, कैल्शियम यात्रियों को एक AFM टिप के साथ सुसंस्कृत ऑस्टियोब्लास्ट्स पर स्थानीय बलों के आवेदन के बाद कैल्शियम अनुपातइमेजिंग के माध्यम से फ्लोरोसेंट ट्रैक किया गया। हाल ही में, AFM कोलेजन फाइब्रिल्स जिस पर यकृत stellate कोशिकाओं (HSC) बड़े हो रहे थे और इस mechano-transduced HSC सक्रियण वास्तविक समय एक फ्लोरोसेंट एस आरसी biosensor, जिसका फॉस्फोरिलेशन द्वारा प्रतिनिधित्व के रूप में द्वारा निगरानी की गई थी खींच करने के लिए नियोजित किया गया था बायोसेंसर की प्रतिदीप्ति तीव्रता एचएससी सक्रियण3से संबंधित है।
AFM आधारित SCFS प्रयोगों में, AFM cantilevers के उचित functionalization सफल माप की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है. चूंकि हमारे अनुसंधान ब्याज प्रतिरक्षा कोशिकाओं सक्रियण पर केंद्रित है, हम नियमित रूप से इस तरह के एक ठोस कणों कि phagocytosis को गति प्रदान कर सकते हैं और / , 15 और एकल टी कोशिकाओं है कि प्रतिजन पेश कोशिकाओं के साथ एक प्रतिरक्षा synapse फार्म कर सकते हैं, जैसे सक्रिय डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी)2. एकल ठोस कणों को आम तौर पर हवा के वातावरण में एक epoxy गोंद के माध्यम से एक cantilver करने के लिए युग्मित कर रहे हैं, जबकि एकल टी कोशिकाओं, उनके गैर चिपकने वाला प्रकृति के कारण, समाधान में एक bioसंगत गोंद के माध्यम से atilever करने के लिए functionalized हैं. यहाँ, हम cantilver संशोधन के इन दो प्रकार के प्रदर्शन और दो संबद्ध अनुप्रयोगों के रूप में अच्छी तरह से देने के लिए तरीकों का वर्णन. पहला आवेदन सेल यांत्रिकी दृष्टिकोण से नियामक टी कोशिकाओं के दमनकारी तंत्र को समझने के लिए एएफएम-एससीएफएस के साथ टी सेल/डीसी बातचीत की जांच करना है। दूसरा एक जीवित सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ एएफएम के संयोजन शामिल है वास्तविक समय में एक ठोस कण के लिए मैक्रोफेज की सेलुलर प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए रिसेप्टर स्वतंत्र फॉस्फेटीलिनोसिटोल के आणविक तंत्र प्रकट 4,5-bisphosphate (PIP2)- मोसिन मध्ये फागोसाइटोसिस. इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए एक संदर्भ रूपरेखा प्रदान करने के लिए डिजाइन और प्रतिरक्षा अनुसंधान के लिए AFM आधारित एकल सेल विश्लेषण के साथ अपने स्वयं के प्रयोगात्मक सेटिंग्स को लागू करने के लिए है.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM आधारित एकल कोशिका बल स्पेक्ट्रोस्कोपी जीवित कोशिकाओं के biophysical गुणों को संबोधित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होने के लिए विकसित किया गया है. उन अनुप्रयोगों के लिए, cantilver ब्याज की कोशिकाओं पर विशिष्ट बा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के जनरल प्रोग्राम (31370878), राज्य कुंजी कार्यक्रम (31630023) और अभिनव अनुसंधान समूह कार्यक्रम (81621002) के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
References
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