Funksjonalisering av Atomic Force mikroskop utkragning med single-T celler eller single-partikkel for immunologiske single-Cell Force spektroskopi
Summary
Vi presenterer en protokoll for å funksjonalisere atomkraftmikroskop (AFM) utkragning med en enkelt T celle og perle partikkel for immunologiske studier. Prosedyrer for å granske single-pair T celle-dendrittiske celle binding av AFM og å overvåke sanntids mobilnettet respons av makrofager til en enkelt solid partikkel av AFM med fluorescens Imaging vises.
Abstract
Atomic Force mikroskopi basert enkelt celle kraft spektroskopi (AFM-SCFS) er et kraftig verktøy for å studere Biofysiske egenskaper levende celler. Denne teknikken gjør det mulig for undersøkelser interaksjon styrker og dynamikk på en levende celle membran, inkludert de mellom celler, reseptor og ligander, og sammen med mange andre varianter. Det fungerer også som en mekanisme for å levere en fysisk eller biokjemiske stimulans på enkeltceller i en spatiotemporally kontrollert måte, og dermed tillater spesifikk celle aktivering og påfølgende cellulære hendelser som skal overvåkes i sanntid når kombinert med live-celle fluorescens avbildning. Nøkkelen trinn i disse AFM-SCFS målingene er AFM-cantilever funksjonalisering, eller med andre ord, knytter et emne av interesse for cantilever. Her presenterer vi metoder for å endre AFM utkragning med en enkelt T-celle og en enkelt polystyren perle henholdsvis for immunologiske studier. Den førstnevnte innebærer en biokompatible lim som par enkelt T-celler til spissen av en flat cantilever i en løsning, mens sistnevnte er avhengig av en epoxy lim for enkelt perle vedheft i luft miljøet. To immunologiske søknader knyttet til hver cantilever modifikasjon er gitt også. Metodene som beskrives her, kan enkelt tilpasses forskjellige celletyper og faste partikler.
Introduction
Atomic Force mikroskopi (AFM), et allsidig verktøy, har funnet mange programmer i Cell Biology Research1,2,3,4,5. Bortsett fra den høye oppløsning Imaging evne, den innfødte Force-undersøkelser funksjonen lar Biofysiske egenskaper levende celler som skal undersøkes direkte in situ på single-cellenivå6,7. Disse inkluderer Stivheter av subcellulære strukturer eller hele celler8,9,10,11,12, spesifikke ligand/reseptor bindende styrke ved enkelt molekylnivå på cellen Surface13, og vedheft styrker mellom enkelt par av faste partikler og celler eller mellom to celler1,2,14,15. De to sistnevnte er ofte kategorisert som single-Cell Force spektroskopi (SCFS)16. På grunn av den lett tilgjengelige utkragning med ulike våren konstant, kraften området tilgjengelig for AFM er ganske bred fra noen få piconewtons (pN) til micronewtons (μN), som tilstrekkelig dekker hele spekteret av cellulære hendelser som involverer styrker fra noen titalls av pN, slik som reseptor-baserte single-molekylet bindende, til nN, for eksempel phagocytic mobilnettet hendelser15. Denne store dynamisk kraft utvalg gjør AFM fordelaktig over andre makt-undersøkelser teknikker som optisk/magnetisk pinsett og en biomembrane kraft sonde, som de er mer egnet for svake-kraft målinger, med makt vanligvis mindre enn 200 pN17 , 18. i tillegg kan AFM fungere som en høy presisjon manipulator å levere ulike stimuli på enkeltceller i en spatiotemporally definert måte4,19. Dette er ønskelig for Real-Time single-celle aktivering studier. Kombinert med live-celle fluorescens Imaging, den påfølgende cellulære responsen til den spesifikke stimulans kan overvåkes samtidig, og dermed gjør AFM-baserte SCFS overmåte robust som optisk Imaging gir et praktisk verktøy for å granske mobilnettet signalering. For eksempel ble AFM brukt til å bestemme stammene som kreves for å lokke fram kalsium transienter i osteoblaster20. I dette arbeidet ble kalsium transienter spores fluorescensmerkete gjennom kalsium ratiometrisk Imaging etter påføring av lokaliserte styrker på kultivert osteoblaster med en AFM spissen. Nylig ble AFM ansatt for å strekke kollagen fibrils som hepatic Stel celler (HSC) ble dyrket og denne mechano-transduced HSC aktivisering var sanntid overvåkes av en fluorescerende src Biosensor, hvis fosforylering som representeres av fluorescens intensiteten av Biosensor er korrelert med HSC aktivisering3.
I AFM-baserte SCFS eksperimenter, riktig funksjonalisering av AFM utkragning er et viktig skritt mot vellykkede målinger. Siden vår forskning interesse fokuserer på immunceller aktivisering, vi rutinemessig funksjonalisere utkragning med partikler saker som enkelt faste partikler som kan utløse fagocytose og/eller sterke immunresponser4,14 , 15 og enkelt T celler som kan danne en immun synapse med antigen presentere celler, for eksempel aktiverte dendrittiske celler (DC)2. Enkelt faste partikler er normalt koblet til en cantilever via en epoxy lim i luft miljøet, mens enkelt T-celler, på grunn av deres ikke-selvklebende natur, er funksjonalisert til en cantilever via en biokompatible lim i løsningen. Her beskriver vi metodene for å utføre disse to typer cantilever modifikasjon og gi to tilhørende applikasjoner også. Det første programmet er å granske T Cell/DC interaksjoner med AFM-SCFS å forstå den undertrykkende mekanismen av regulatoriske T-celler fra cellen mekanikk synspunkt. Den andre innebærer å kombinere AFM med live-celle fluorescens Imaging å overvåke cellulære responsen av macrophage til en solid partikkel i sanntid for å avdekke den molekylære mekanismen av reseptor-uavhengige phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)- Moesin mediert fagocytose. Målet med denne protokollen er å gi en referanse rammeverk for interesserte forskere til å designe og implementere sine egne eksperimentelle innstillinger med AFM-basert enkelt celle analyse for immunologiske forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM-baserte enkelt celle kraft spektroskopi har utviklet seg til å være et kraftig verktøy for å ta opp de Biofysiske egenskapene til levende celler. For disse programmene, må cantilever være funksjonalisert riktig for å granske bestemte interaksjoner eller egenskaper på celler av interesse. Her er metodene for kobling enkelt T-celle og enkelt mikron størrelse perle til spissen-mindre cantilever er beskrevet henholdsvis. For å feste en enkelt T-celle til cantilever, ble en biokompatible lim valgt som celle lim….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation i Kina General program (31370878), State Key program (31630023) og innovative Research Group program (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
References
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) – a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
