Funktionalisering av atomkraftmikroskop Cantispakar med Single-T-celler eller Single-partikel för immunologiska Single-cell Force spektroskopi
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att funktionalisera atomkraftmikroskop (AFM) cantispakar med en enda T-cell och pärla partikel för immunologiska studier. Procedurer för avsökning av enpar T cell-dendritiska cell bindning av AFM och för att övervaka realtid cellulära svar av makrofager till en enda solid partikel av AFM med fluorescens Imaging visas.
Abstract
Atomic Force mikroskopi baserad Single cell Force spektroskopi (AFM-SCFS) är ett kraftfullt verktyg för att studera biofysiska egenskaper hos levande celler. Denna teknik gör det möjligt att sondera interaktions styrkor och dynamik på en levande cellmembran, inklusive de mellan celler, receptor och ligander, och tillsammans med många andra variationer. Det fungerar också som en mekanism för att leverera en fysisk eller biokemisk stimulans på enstaka celler i ett rumsligt kontrollerat sätt, vilket möjliggör specifik cell aktivering och efterföljande cellulära händelser som ska övervakas i realtid när de kombineras med levande-cell fluorescens-avbildning. Det viktigaste steget i dessa AFM-SCFS mätningar är AFM-cantilever funktionalisering, eller med andra ord, bifoga ett föremål av intresse för cantilever. Här presenterar vi metoder för att modifiera AFM-cantispakar med en enda T-cell och en enda polystyren-pärla respektive för immunologiska studier. Den förstnämnda innebär ett biokompatibelt lim som par enda T-celler till spetsen av en platt grenställ i en lösning, medan den senare förlitar sig på en epoxilim för enkel pärla vidhäftning i luftmiljön. Två immunologiska tillämpningar som är förknippade med varje grenställ modifiering finns också. De metoder som beskrivs här kan enkelt anpassas till olika celltyper och fasta partiklar.
Introduction
Atomic Force microskopi (AFM), ett mångsidigt verktyg, har funnit många tillämpningar inom cellbiologi forskning1,2,3,4,5. Bortsett från dess högupplöst avbildning förmåga, den infödda kraft-sondering funktionen kan biofysiska egenskaper levande celler som skall undersökas direkt på plats på encellig nivå6,7. Dessa inkluderar rigiditeter av subcellulära strukturer eller ens hela celler8,9,10,11,12, specifika ligand/receptor bindande styrkor vid enmolekylen nivå på cellytan13, och vidhäftning styrkor mellan enstaka par av fasta partiklar och celler eller mellan två celler1,2,14,15. De två sistnämnda kategoriseras ofta som Single-cell Force spektroskopi (SCFS)16. På grund av de lättillgängliga cantispakarna med olika vårkonstant, är kraft intervallet tillgänglig för AFM ganska bred från några piconewtons (pN) till micronewtons (μN), som på lämpligt sätt täcker hela sortimentet av cellulära händelser som involverar styrkor från några tiotal av pN, såsom receptor-baserad enkel molekyl bindning, till nN, såsom fagocytiska cellulära händelser15. Detta stora dynamiska kraft sortiment gör AFM fördelaktigt över andra kraft-sondering tekniker såsom optisk/magnetisk pincett och en Biomembrane kraft sond, eftersom de är mer lämpade för svaga kraftmätningar, med kraft typiskt mindre än 200 pN17 , 18. AFM kan dessutom fungera som en högprecisions manipulator för att leverera olika stimuli till enstaka celler i ett rumsligt definierat sätt4,19. Detta är önskvärt för realtid encells aktivering studier. Kombinerat med Live-cells fluorescens Imaging, den efterföljande cellulära svar på den specifika stimulansen kan övervakas samtidigt, vilket gör AFM-baserade SCFS ytterst robust som optisk avbildning ger ett praktiskt verktyg för att sond cellulära signalering. Till exempel, AFM användes för att bestämma de stammar som krävs för att framkalla kalcium transienter i osteoblaster20. I detta arbete, kalcium transienter spåras överföras genom kalcium ratiometriska Imaging efter applicering av lokaliserade styrkor på odlade osteoblaster med en AFM spets. Nyligen var AFM anställd för att sträcka kollagen fibriller på vilka hepatiska stellate celler (HSC) odlades och denna Mechano-transduced HSC aktiveringen var realtid övervakas av en fluorescerande src biosensor, vars fosforylering som representeras av fluorescensintensiteten hos biosensorn är korrelerad med HSC-aktivering3.
I AFM-baserade SCFS experiment är korrekt funktionalisering av AFM cantispakar ett avgörande steg mot lyckade mätningar. Eftersom vårt forskningsintresse fokuserar på aktivering av immunceller, funktionaliserar vi rutinmässigt cantispakar med partiklar som enstaka fasta partiklar som kan utlösa fagocytos och/eller starka immunsvar4,14 , 15 och enstaka T-celler som kan bilda en immun synaps med antigen presenterande celler, såsom aktiverade dendritiska celler (DC)2. Enstaka fasta partiklar kopplas normalt till en grenställ via ett epoxilim i luftmiljön, medan enstaka T-celler, på grund av sin icke-adhesiva natur, funktionaliseras till en grenställ via ett biokompatibelt lim i lösning. Här beskriver vi metoderna för att utföra dessa två typer av grenställ modifiering och ge två tillhörande applikationer också. Den första ansökan är att sond T cell/DC interaktioner med AFM-SCFS att förstå den suppressiva mekanismen av reglerande T-celler från cellmekanik synvinkel. Den andra innebär att kombinera AFM med levande cell fluorescens Imaging att övervaka cellulära svaret av makrofagen till en solid partikel i realtid för att avslöja den molekylära mekanismen för receptor-oberoende fosfatidylinositol 4,5-bisfosfoner (PIP2)- Moesin medierade fagocytos. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en referensram för intresserade forskare att utforma och genomföra sina egna experimentella inställningar med AFM-baserad encellsanalys för immunologisk forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM-baserade Single-cell Force spektroskopi har utvecklats till att vara ett kraftfullt verktyg för att hantera de biofysiska egenskaperna hos levande celler. För dessa tillämpningar, grenställ måste funktionaliseras korrekt för att avsöka specifika interaktioner eller egenskaper på cellerna av intresse. Här, metoderna för koppling enda T-cell och enda micron-storlek pärla till spetsen-mindre grenställ beskrivs respektive. För att fästa en enda T-cell till cantilever, valdes ett biokompatibelt lim som celll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation of China General program (31370878), State Key program (31630023) och nyskapande Research Group program (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
References
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) – a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
