استخدام كريسبر / Cas9 لضرب جنرال موتورز-CSF في خلايا CAR-T
Summary
هنا، نقدم بروتوكولا ً للتحرير الوراثي لخلايا CAR-T عبر نظام CRISPR/Cas9.
Abstract
مستقبلات مستضد Chimeric T (CAR-T) العلاج الخلوي هو أحدث ويحتمل أن تكون ثورية خيار العلاج الجديد للسرطان. ومع ذلك، هناك قيود كبيرة على استخدامه على نطاق واسع في علاج السرطان. وتشمل هذه القيود تطوير سمية فريدة من نوعها مثل متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) والسمية العصبية (NT) والتوسع المحدود، وظائف التأثير، والنشاط المضاد للورم في الأورام الصلبة. وتتمثل إحدى الاستراتيجيات الرامية إلى تعزيز فعالية CAR-T و/أو السيطرة على سمية خلايا CAR-T في تحرير جينوم خلايا CAR-T نفسها أثناء تصنيع خلايا CAR-T. هنا، ونحن نصف استخدام كريسبر / Cas9 تحرير الجينات في خلايا CAR-T عن طريق transduction مع بنية لينتيفيروسي تحتوي على دليل RNA إلى حبيبات الضامة مستعمرة تحفيز عامل (GM-CSF) وCas9. على سبيل المثال، نحن نصف كريسبر / Cas9 بوساطة بالضربة القاضية من GM-CSF. لقد أظهرنا أن هذه الخلايا GM-CSFك / س CAR-T تنتج بشكل فعال أقل GM-CSF مع الحفاظ على وظيفة الخلية T الحرجة وتؤدي إلى تعزيز النشاط المضاد للورم في الجسم الحي مقارنة مع خلايا CAR-T من النوع البري.
Introduction
مستقبلات مستضد Chimeric T (CAR-T) العلاج الخلوي معارض وعد كبير في علاج السرطان. 1 , 2 اثنين من العلاجات الخلية CAR-T التي تستهدف CD19 (CART19) تمت الموافقة عليها مؤخرا في الولايات المتحدة في أوروبا لاستخدامها في الأورام الخبيثة الخلية B بعد إظهار نتائج ملفتة للنظر في التجارب السريرية متعددة المراكز. 3 , 4 , 5 الحواجز التي تحول دون الاستخدام الأكثر انتشاراً لخلايا CAR-T هي نشاط محدود في الأورام الصلبة والسمية المرتبطة بها بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) والسمية العصبية (NT). 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 لتعزيز المؤشر العلاجي للعلاج بالخلايا CAR-T، يتم استخدام أدوات هندسة الجينوم مثل nucleases إصبع الزنك، TALENs، وCRISPR لمزيد من تعديل خلايا CAR-T في محاولة لتوليد خلايا CAR-T أقل سمية أو أكثر فعالية. 10 سنوات , 11
في هذه المقالة، نقوم بوصف طريقة لتوليد خلايا CAR-T تحرير CRISPR/Cas9. والهدف المحدد من هذه الطريقة هو تعديل وراثيا خلايا CAR-T أثناء تصنيع الخلايا CAR-T عن طريق CRISPR /Cas9 لتوليد خلايا CAR-T أقل سمية أو أكثر فعالية. ويستند الأساس المنطقي لتطوير هذه المنهجية على الدروس المستفادة من التجربة السريرية للعلاج بالخلايا CAR-T، مما يشير إلى الحاجة الملحة لاستراتيجيات جديدة لزيادة النافذة العلاجية للعلاج بالخلايا CAR-T وتوسيع نطاق التطبيق إلى الأورام الأخرى ويدعمها التقدم الأخير في البيولوجيا الاصطناعية مما يسمح تعديلات متعددة من خلايا CAR-T التي بدأت في دخول العيادة. في حين يتم تطوير العديد من أدوات هندسة الجينوم وتطبيقها في بيئات مختلفة، مثل nucleases إصبع الزنك، TALENs، وCRISPR، منهجيتنا تصف تعديل CRISPR /Cas9 من خلايا CAR-T. 10 سنوات , 11 CRISPR/Cas9 هو آلية الدفاع البكتيرية المستندة إلى الحمض النووي الريبي التي تم تصميمها للقضاء على الحمض النووي الأجنبي. يعتمد CRISPR على endonucleases لشق تسلسل مستهدف تم تحديده من خلال دليل RNA (gRNA). يوفر تحرير كريسبر لخلايا CAR-T العديد من المزايا على الأدوات الهندسية الأخرى للجينوم. وتشمل هذه الدقة في تسلسل gRNA، والبساطة لتصميم gRNA استهداف جين الاهتمام، وكفاءة تحرير الجينات العالية، والقدرة على استهداف جينات متعددة حيث يمكن استخدام gRNAs متعددة في نفس الوقت.
على وجه التحديد في الأساليب الموصوفة هنا، استخدمنا عدس ترميز كريسبر دليل RNA وCas9 لتعطيل الجينات أثناء نقل CAR من الخلايا T. في اختيار تقنية مناسبة لتحرير خلايا CAR-T، نقترح التقنية الموصوفة هنا هي آلية فعالة لتوليد خلايا CAR-T الصف البحوث، ولكن لأن تأثير على المدى الطويل من التكامل الدائم من Cas9 في الجينوم غير معروف، ونحن اقتراح هذه المنهجية لتطوير دليل على مفهوم البحوث الصف CAR-T الخلايا ولكن ليس لإنتاج جيد تصنيع الممارسة الصف CAR-T الخلايا.
على وجه الخصوص، هنا نقوم بوصف جيل من الخلايا الحبيبية الضامة مستعمرة تحفيز عامل (GM-CSF) بالضربة القاضية CAR-T الخلايا التي تستهدف CD19 البشرية. تم إنشاء هذه الخلايا CAR-T عن طريق التحويل مع الجسيمات اللينة ترميز الحمض النووي الريبي دليل محدد إلى GM-CSF (اسم الجينات CSF2) وCas9. وجدنا سابقا أن تحييد GM-CSF يخفف CRS وNT في نموذج xenograft. 12 GM-CSFك / س CAR-T الخلايا تسمح لتثبيط GM-CSF خلال عملية التصنيع، والحد بشكل فعال من إنتاج GM-CSF مع تعزيز CAR-T خلية النشاط المضاد للورم والبقاء على قيد الحياة في الجسم الحي مقارنة مع خلايا CAR-T من النوع البري. 12 وهكذا، هنا نحن نقدم منهجية لتوليد كريسبر / Cas9 تحرير خلايا CAR-T.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا التقرير، نقوم بوصف منهجية لاستخدام تكنولوجيا CRISPR/Cas9 للحث على إدخال تعديلات ثانوية في خلايا CAR-T. وعلى وجه التحديد، يتضح ذلك باستخدام الانكلب الفيروسي مع ناقل فيروسي يحتوي على gRNA يستهدف جين الاهتمام وCas9 لتوليد خلايا GM-CSFk/o CART19. كنا قد أظهرت سابقا أن تحييد GM-CSF يخفف CRS وNT في نموذج xeno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح من K12CA090628 (SSK)، والشبكة الوطنية الشاملة للسرطان (SSK)، ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK)، ومؤسسة بريدولين (SSK)، ومكتب مايو كلينيك للترجمة إلى الممارسة (SSK)، و برنامج تدريب العلماء الطبيين في Mayo Clinic (مايو كلينك) روبرت ل. هاويل من المنح الدراسية للأطباء والعلماء (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
- Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
- Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
