Использование CRISPR/Cas9 для выбивания GM-CSF в клетках CAR-T
Summary
Здесь мы представляем протокол для генетического отсвагивая клетки CAR-T через систему CRISPR/Cas9.
Abstract
Химерный рецептор антигена T (CAR-T) клеточная терапия является передний край и потенциально революционный новый вариант лечения рака. Тем не менее, существуют значительные ограничения на его широкое применение в лечении рака. Эти ограничения включают в себя развитие уникальных токсичностей, таких как синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (NT) и ограниченное расширение, функции эффектора и противоопухолевую активность в твердых опухолях. Одной из стратегий повышения эффективности CAR-T и/или контроля токсичности клеток CAR-T является редактирование генома самих клеток CAR-T во время производства клеток CAR-T. Здесь мы описываем использование редактирования генов CRISPR/Cas9 в клетках CAR-T с помощью трансдукции с лентивирусной конструкцией, содержащей направляющий РНК к гранулоцитной колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF) и Cas9. В качестве примера мы описываем CRISPR/Cas9 при посредничестве GM-CSF. Мы показали, что эти ГМ-CSFк / о CAR-T клетки эффективно производят меньше ГМ-CSF при сохранении критической функции Т-клеток и привести к повышению противоопухолевой активности in vivo по сравнению с дикими клетками типа CAR-T.
Introduction
Химерный рецептор антигена T (CAR-T) клеточная терапия демонстрирует большие перспективы в лечении рака. 1 , 2 Две CAR-T клеточной терапии ориентации CD19 (CART19) были недавно утверждены в Соединенных Заявленные и в Европе для использования в злокачественных новообразованиях клеток B после демонстрации поразительных результатов в многоцентровых клинических испытаний. 3 , 4 , 5 Барьерами для более широкого использования CAR-T-клеток являются ограниченная активность в твердых опухолях и связанных с ними токсичности, включая синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (NT). 3 , 5 , 6 , 7 (г. , 8 , 9 Для повышения терапевтического индекса клеточной терапии CAR-T, инженерные инструменты генома, такие как нуклеазы цинковых пальцев, TALENs и CRISPR используются для дальнейшего изменения car-T-клеток в попытке создать менее токсичные или более эффективные клетки CAR-T. 10 Лет , 11 Год
В этой статье мы описываем метод создания CRISPR/Cas9, отредактированных CAR-T-ячеек. Конкретная цель этого метода заключается в том, чтобы генетически модифицировать CAR-T-клетки во время производства клеток CAR-T через CRISPR/Cas9 для создания менее токсичных или более эффективных клеток CAR-T. Обоснование для разработки этой методологии основывается на уроках, извлеченных из клинического опыта клеточной терапии CAR-T, что указывает на настоятельную необходимость новых стратегий для увеличения терапевтического окна клеточной терапии CAR-T и расширения применения в других опухолей и поддерживается последние достижения в синтетической биологии позволяет несколько модификаций CAR-T клеток, которые начали поступать в клинику. В то время как несколько инженерных инструментов генома разрабатываются и применяются в различных условиях, таких как нуклеазы цинковых пальцев, TALENs и CRISPR, наша методология описывает модификацию CRISPR/Cas9 клеток CAR-T. 10 Лет , 11 CRISPR/Cas9 является РНК-механизм защиты от бактерий, который предназначен для устранения чужеродных ДНК. CRISPR полагается на эндонуклеазы, чтобы расщеплять целевую последовательность, идентифицированную через направляющий РНК (gRNA). CRISPR редактирования CAR-T клеток предлагает ряд преимуществ по сравнению с другими инструментами инженерного генома. К ним относятся точность последовательности gRNA, простота для разработки gRNA ориентации гена интереса, высокая эффективность редактирования генов, и способность целевых нескольких генов, поскольку несколько гРНК могут быть использованы в то же время.
В частности, в методах, описанных здесь, мы использовали лентивирус, кодируя CRISPR руководство РНК и Cas9 нарушить ген во время трансдукции Т-клеток CAR. При выборе подходящей техники для редактирования CAR-T-клеток, мы предлагаем метод, описанный здесь является эффективным механизмом для создания исследований класса CAR-T клеток, а потому, что долгосрочный эффект постоянной интеграции Cas9 в геном неизвестен, мы предложить эту методологию для разработки доказательства концепции исследования класса CAR-T клеток, но не для производства хорошей производственной практике класса CAR-T клеток.
В частности, здесь мы описываем генерацию гранулоцитов макрофагов колонии стимулирующий фактор (GM-CSF) нокаутОМ CAR-T клеток ориентации человека CD19. Эти клетки CAR-T были созданы путем трансдукции с лентивирными частицами, кодируя направляющую РНК, специфичную для GM-CSF (генное название CSF2) и Cas9. Ранее мы обнаружили, что нейтрализация GM-CSF упрощает CRS и NT в модели ксенотрансплантата. 12 ГМ-CSFk/o CAR-T-клетки позволяют ингибировать ГМ-CSF в процессе производства, эффективно снижая производство ГМ-CSF при одновременном повышении противоопухолевой активности CAR-T и выживания в vivo по сравнению с клетками WILDtype CAR-T. 12 Таким образом, здесь мы предоставляем методологию для создания CRISPR/Cas9 отредактированные клетки CAR-T.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом отчете мы описываем методологию использования технологии CRISPR/Cas9 для индуцирования вторичных изменений в клетках CAR-T. В частности, это продемонстрировано с помощью лентивирусной трансдукции с вирусным вектором, который содержит gRNA ориентации гена интереса и Cas9 для создания ГМ-CSF…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана за счет грантов от K12CA090628 (SSK), Национальной комплексной онкологической сети (SSK), Клиника Майо Центр индивидуальной медицины (SSK), Фонд Предолин (SSK), клиника Майо Бюро перевода на практике (SSK), и Клиника Майо Медицинская Программа обучения ученых Роберт Л. Хауэлл Врач-ученый стипендий (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
- Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
- Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
