Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Bearbeitung von CAR-T-Zellen über ein CRISPR/Cas9-System vor.
Abstract
Chimäre Antigenrezeptor T (CAR-T) Zelltherapie ist eine innovative und potenziell revolutionäre neue Behandlungsoption für Krebs. Allerdings gibt es erhebliche Einschränkungen für seine weit verbreitete Verwendung bei der Behandlung von Krebs. Zu diesen Einschränkungen gehören die Entwicklung einzigartiger Toxizitäten wie Zytokin-Release-Syndrom (CRS) und Neurotoxizität (NT) und begrenzte Expansion, Effektorfunktionen und Anti-Tumor-Aktivität bei soliden Tumoren. Eine Strategie zur Verbesserung der CAR-T-Wirksamkeit und/oder zur Kontrolle der Toxizität von CAR-T-Zellen besteht darin, das Genom der CAR-T-Zellen während der Herstellung von CAR-T-Zellen selbst zu bearbeiten. Hier beschreiben wir die Verwendung von CRISPR/Cas9 Gen-Editing in CAR-T-Zellen mittels Transduktion mit einem lentiviralen Konstrukt, das eine Führungs-RNA zum Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) und Cas9 enthält. Als Beispiel nennen wir CRISPR/Cas9 vermittelten Knockout von GM-CSF. Wir haben gezeigt, dass diese GM-CSFk/o CAR-T-Zellen effektiv weniger GM-CSF produzieren, während sie die kritische T-Zellfunktion beibehalten und zu einer verbesserten Anti-Tumor-Aktivität in vivo im Vergleich zu wilden CAR-T-Zellen führen.
Introduction
Chimäre Antigenrezeptor T (CAR-T) Zelltherapie zeigt großes Versprechen in der Behandlung von Krebs. 1 , 2 Zwei CAR-T-Zelltherapien, die auf CD19 (CART19) abzielen, wurden kürzlich in den Vereinigten Staaten und in Europa für die Anwendung bei B-Zell-Malignitäten zugelassen, nachdem sie auffällige Ergebnisse in multizentrischen klinischen Studien nachgewiesen hatten. 3 , 4 , 5 Hindernisse für eine breitere Nutzung von CAR-T-Zellen sind begrenzte Aktivität bei soliden Tumoren und damit verbundenen Toxizitäten wie Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) und Neurotoxizität (NT). 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Um den therapeutischen Index der CAR-T-Zelltherapie zu verbessern, werden Genom-Engineering-Tools wie Zinkfingernukleasen, TALENs und CRISPR eingesetzt, um CAR-T-Zellen weiter zu modifizieren, um weniger toxische oder effektivere CAR-T-Zellen zu erzeugen. 10 , 11
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zum Generieren von CRISPR/Cas9-bearbeiteten CAR-T-Zellen. Das spezifische Ziel dieser Methode ist es, CAR-T-Zellen während der HERSTELLUNG von CAR-T-Zellen über CRISPR/Cas9 genetisch zu modifizieren, um weniger toxische oder effektivere CAR-T-Zellen zu erzeugen. Die Gründe für die Entwicklung dieser Methodik basieren auf den Erkenntnissen aus klinischen Erfahrungen mit der CAR-T-Zelltherapie, die auf die dringende Notwendigkeit neuer Strategien hinweisen, um das therapeutische Fenster der CAR-T-Zelltherapie zu erhöhen und die Anwendung auf andere Tumoren und wird durch die jüngsten Fortschritte in der synthetischen Biologie unterstützt, die mehrere Modifikationen von CAR-T-Zellen ermöglichen, die begonnen haben, in die Klinik zu gelangen. Während mehrere Genom-Engineering-Tools entwickelt und in verschiedenen Umgebungen eingesetzt werden, wie Z.B. Zinkfingernukleasen, TALENs und CRISPR, beschreibt unsere Methodik die CRISPR/Cas9-Modifikation von CAR-T-Zellen. 10 , 11 CRISPR/Cas9 ist ein RNA-basierter bakterieller Abwehrmechanismus, der entwickelt wurde, um fremde DNA zu eliminieren. CRISPR stützt sich auf Endonukleasen, um eine Zielsequenz zu spalten, die durch eine Guide-RNA (gRNA) identifiziert wurde. Die CRISPR-Bearbeitung von CAR-T-Zellen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Genom-Engineering-Tools. Dazu gehören die Genauigkeit der gRNA-Sequenz, die Einfachheit bei der Entwicklung einer gRNA, die auf das Gen von Interesse abzielt, eine hohe Gen-Editing-Effizienz und die Fähigkeit, mehrere Gene anzusprechen, da mehrere gRNAs gleichzeitig verwendet werden können.
Insbesondere in den hier beschriebenen Methoden verwendeten wir eine Lentivirus-Codierung von CRISPR-Guide-RNA und Cas9, um ein Gen während der CAR-Transduktion von T-Zellen zu stören. Bei der Auswahl einer geeigneten Technik zur Bearbeitung von CAR-T-Zellen schlagen wir vor, dass die hier beschriebene Technik ein effizienter Mechanismus zur Erzeugung von CAR-T-Zellen der Forschungsstufe ist, aber da die langfristige Wirkung einer dauerhaften Integration von Cas9 in das Genom unbekannt ist, schlagen diese Methode vor, um den Nachweis der Konzeptforschung Car-T-Zellen zu entwickeln, aber nicht für die Herstellung guter Herstellungspraxis Grade CAR-T-Zellen.
Insbesondere beschreiben wir hier die Erzeugung von Granulozyten-Makrophagen-Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) Knockout CAR-T-Zellen, die auf menschliche CD19 abzielen. Diese CAR-T-Zellen wurden durch Transduktion mit lentiviralen Partikeln erzeugt, die eine Fürleitungs-RNA spezifisch für GM-CSF (Genname CSF2) und Cas9 kodieren. Wir haben zuvor festgestellt, dass die GM-CSF-Neutralisation CRS und NT in einem Xenograft-Modell verbessert. 12 GM-CSFk/o CAR-T-Zellen ermöglichen die Hemmung von GM-CSF während des Herstellungsprozesses, wodurch die Produktion von GM-CSF effektiv reduziert wird und gleichzeitig die Antitumoraktivität und das Überleben von CAR-T-Zellen in vivo im Vergleich zu Wildtyp-CAR-T-Zellen verbessert werden. 12 Hier bieten wir daher eine Methodik zur Generierung von CRISPR/Cas9-bearbeiteten CAR-T-Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht beschreiben wir eine Methodik zur Nutzung der CRISPR/Cas9-Technologie, um sekundäre Modifikationen in CAR-T-Zellen zu induzieren. Insbesondere wird dies mit hilfe einer lentiviralen Transduktion mit einem viralen Vektor demonstriert, der gRNA enthält, die auf das Gen von Interesse und Cas9 zur Erzeugung von GM-CSFk/o CART19-Zellen abzielt. Wir hatten zuvor gezeigt, dass die GM-CSF-Neutralisation CRS und NT in einem Xenograft-Modell verbessert. 12 Wie bereits beschrie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien von K12CA090628 (SSK), dem National Comprehensive Cancer Network (SSK), dem Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), der Predolin Foundation (SSK), dem Mayo Clinic Office of Translation to Practice (SSK) und das Mayo Clinic Medical Scientist Training Program Robert L. Howell Physician-Scientist Scholarship (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
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