CAR-T hücrelerinde GM-CSF ' ı Knock Out için CRISPR/Cas9 kullanma
Summary
Burada, bir CRISPR/Cas9 sistemi üzerinden araç-T hücrelerini genetik olarak düzenlemek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Chimerik antijen reseptör T (CAR-T) hücre tedavisi, kanser için bir kesme kenarı ve potansiyel olarak devrimci yeni tedavi seçeneğidir. Ancak, kanser tedavisinde yaygın kullanımı için önemli sınırlamalar vardır. Bu sınırlamalar, sitokin serbest bırakma Sendromu (CRS) ve nörotoksisite (NT) ve sınırlı genişleme, efektör fonksiyonları ve katı tümörlerde anti-tümör aktivitesi gibi benzersiz toksisitelerin gelişmesini içerir. Bir strateji Car-t etkinliğini artırmak için ve/veya CAR-t hücrelerinin kontrol toksisiteleri Car-t hücre üretimi sırasında kendilerini CAR-k hücrelerinin genomu düzenlemek için. Burada, araç-T hücrelerinde CRISPR/Cas9 gen düzenlemenin, granülocayt makrophaj kolonisi uyarıcı faktörüne (GM-CSF) ve Cas9 için bir kılavuz RNA içeren bir lentiviral yapı ile dönüştürücü yoluyla kullanımını tarif ediyoruz. Örnek olarak, biz GM-CSF CRISPR/Cas9 aracılı nakavt açıklanmaktadır. Biz bu GM-CSFk/o Car-t hücrelerinin etkili daha az GM-CSF kritik T hücre fonksiyonu koruyarak ve gelişmiş anti-tümör aktivite içinde vivo VAHŞI tip Car-T hücrelere kıyasla sonuç ürettiğimiz göstermiştir.
Introduction
Chimerik antijen reseptör T (CAR-T) hücre tedavisi kanser tedavisinde büyük söz sergiler. 1 , CD19 (CART19) hedefleyen 2 adet Car-T hücre terapisi, son zamanlarda Birleşik belirtilen ve Avrupa ‘da çok merkezli klinik çalışmalarda çarpıcı sonuçlar gösterdikten sonra B hücreli malignite kullanımı için onaylanmıştır. 3 ‘ ü , 4 , CAR-T hücrelerinin daha yaygın kullanımına yönelik 5 bariyer, katı tümörlerde ve sitokin serbest bırakma Sendromu (CRS) ve NÖROTOKSISITE (NT) dahil olmak üzere ilişkili toksisitelerde sınırlıdır. 3 ‘ ü , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Car-t hücre tedavisinin terapötik indeksi geliştirmek için, çinko parmak nükrenler gibi genom mühendislik araçları, Talens, ve CRıNPR daha az toksik veya daha etkili Car-t hücreleri oluşturmak için bir GIRIŞIM daha Car-t hücreleri değiştirmek için kullanılmaktadır. 10 ‘ dan fazla , 11 ‘ i
Bu yazıda, CRISPR/Cas9 düzenlenmiş CAR-T hücrelerini oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemin spesifik amacı, daha az toksik veya daha etkili CAR-T hücreleri oluşturmak için CRISPR/Cas9 üzerinden CAR-t hücre üretimi sırasında araç-T hücrelerini genetik olarak değiştirmenizi sağlamaktır. Bu metodolojisi geliştirmek için mantık, Car-t hücre tedavisinin terapötik penceresini artırmak ve uygulama genişletmek için yeni stratejiler için acil bir ihtiyaç gösterir CAR-T hücre tedavisinin klinik deneyiminden öğrenilen dersler üzerine kurulmuştur diğer tümörler ve klinik girmeye başladı CAR-T hücrelerin birden fazla değişiklik sağlayan sentetik biyoloji son gelişmeler tarafından desteklenmektedir. Çeşitli genom mühendislik araçları geliştirilmiştir ve çinko parmak nükler, TALENs ve JıSPR gibi farklı ayarlarla uygulandığında, metodolojimiz CAR-T hücrelerinin CRISPR/Cas9 modifikasyonu açıklanmaktadır. 10 ‘ dan fazla , 11 Crispr/Cas9, yabancı DNA ‘yı ortadan kaldırmak IÇIN tasarlanan RNA bazlı bir bakteriyel savunma mekanizmasıdır. CRıSPR, bir kılavuz RNA (gRNA) aracılığıyla tanımlanan bir hedef sırasını ayırmak için endonükleazları kullanır. CAR-T hücrelerinin CRıNPR düzenleme diğer genom mühendislik araçları üzerinde çeşitli avantajlar sunar. Bu, gRNA dizisinin hassasiyetini, faiz geni, yüksek gen düzenleme verimliliği ve birden fazla gRNAs aynı anda kullanılabilir olduğundan birden çok geni hedefleme yeteneğini hedefleyen bir gRNA tasarlamak için basitlik içerir.
Özellikle burada açıklanan yöntemlerle, bir Lentivirus kodlama CRıPR Kılavuzu RNA ve Cas9 T hücrelerinin araba dönüştürücü sırasında bir geni bozmak için kullanılır. CAR-T hücrelerini düzenlemek için uygun bir tekniği seçerken, burada açıklanan tekniği araştırma notu CAR-T hücreleri oluşturmak için etkili bir mekanizma olduğunu öneririz, ancak genom içine Cas9 kalıcı entegrasyonu uzun vadeli etkisi bilinmiyor, biz Konsept araştırma notu CAR-T hücrelerinin kanıtı geliştirmek için bu metodoloji önermek ama iyi üretim uygulama notu CAR-T hücreleri üretmek için değil.
Özellikle, burada granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) nakavt Car-T hücreleri insan CD19 hedefleyen nesil açıklanmaktadır. Bu CAR-T hücreleri lentiviral parçacıklar GM-CSF (gen adı CSF2) ve Cas9 özel bir kılavuz RNA kodlama ile dönüştürücü tarafından oluşturuldu. Daha önce GM-CSF nötralizasyonu bir xenograft modelinde CRS ve NT iyileştirir bulundu. 12 GM-CSFk/o Car-t hücreleri GM-CSF üretim sürecinde inhibisyonu IÇIN izin, etkili GM-CSF üretimini azaltarak ise Car-t hücre anti-tümör aktivitesi ve hayatta kalma IÇINDE vivo wildtype Car-t hücrelere kıyasla artırır. 12 böylece, burada Crispr/CAS9 düzenlenmiş Car-T hücreleri oluşturmak için bir metodoloji sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda, CAR-T hücrelerinde ikincil modifikasyonları teşvik etmek için CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanmak üzere bir metodoloji açıklanmaktadır. Özellikle, bu gRNA faiz gen hedefleme ve GM-CSFk/o CART19 hücreleri oluşturmak için Cas9 içeren bir viral vektör ile lentiviral dönüştürücü kullanılarak gösterilmiştir. Daha önce GM-CSF nötralizasyonu bir xenograft modelinde CRS ve NT iyileştirir göstermiştir. 12 daha önce açıklandığı gıbı, GM-CSFk/o<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma K12CA090628 (SSK), Ulusal kapsamlı kanser ağı (SSK), Mayo Clinic Center bireyselleştirilmiş Tıp (SSK), Predolin Vakfı (SSK), Mayo Clinic Office çeviri uygulama (SSK) gelen hibe yoluyla destekleniyordu ve Mayo Clinic tıp bilimcisi eğitim programı Robert L. Howell hekim-bilim adamı Bursu (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
- Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
- Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
