CRISPR/Cas9を使用してCAR-TセルのGM-CSFをノックアウト
Summary
ここでは、CRISPR/Cas9システムを介してCAR-T細胞を遺伝的に編集するプロトコルを提示する。
Abstract
キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、がんに対する最先端かつ潜在的に革命的な新しい治療オプションです。しかし、癌の治療におけるその広範な使用には重大な制限がある。これらの制限には、サイトカイン放出症候群(CRS)および神経毒性(NT)などのユニークな毒性の開発と、固形腫瘍における限定的な拡張、エフェクター機能、および抗腫瘍活性が含まれる。CAR-T細胞の有効性および/または制御毒性を高めるための1つの戦略は、CAR-T細胞製造中にCAR-T細胞自体のゲノムを編集することです。ここでは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)およびCas9へのガイドRNAを含むレンチウイルス構造を用いたトランスダクションによるCAR-T細胞におけるCRISPR/Cas9遺伝子編集の使用について述べた。例として、GM-CSFのCRISPR/Cas9媒介ノックアウトについて説明する。これらのGM-CSFk/o CAR-T細胞は、重要なT細胞機能を維持しながらGM-CSFを効果的に産生し、野生型CAR-T細胞と比較して生体内で抗腫瘍活性を高める結果をもたらすことを示した。
Introduction
キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、癌の治療において大きな期待を示す。1,2 CD19(CART19)を標的とする2つのCAR-T細胞療法は、マルチセンター臨床試験で顕著な結果を実証した後、B細胞悪性腫瘍の使用のために最近、米国で承認されました。3,4,5 CAR-T細胞のより広範な使用への障壁は、固形腫瘍およびサイトカイン放出症候群(CRS)および神経毒性(NT)を含む関連毒性における限られた活性である。3,5,6,7,8,9 CAR-T細胞治療の治療指標を高めるために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、タレン、CRISPRなどのゲノム工学ツールを用いて、CAR-T細胞をさらに改変し、毒性の低い、またはより効果的なCAR-T細胞を生成する試みを行います。10歳,11歳
この記事では、CRISPR/Cas9編集CAR-Tセルを生成する方法について説明します。この方法の具体的な目的は、CRISPR/Cas9を介したCAR-T細胞製造中にCAR-T細胞を遺伝的に改変し、毒性が低い、またはより効果的なCAR-T細胞を生成することです。この方法論を開発するための根拠は、CAR-T細胞療法の臨床経験から学んだ教訓に基づいて構築されており、CAR-T細胞療法の治療窓口を拡大し、適用を拡大するための新しい戦略の緊急の必要性を示しています。他の腫瘍および合成生物学の最近の進歩によって支えられ、診療所に入り始めたCAR-T細胞の複数の修飾を可能にする。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、タレン、CRISPRなど、さまざまな設定で複数のゲノム工学ツールが開発・応用されていますが、CAR-T細胞のCRISPR/Cas9改質について説明しています。10歳,11 CRISPR/Cas9は外来DNAを除去するように設計されているRNAベースの細菌防御機構である。CRISPRは、ガイドRNA(gRNA)を介して同定された標的配列を切り分けるためにエンドノクレアーゼに依存しています。CAR-T細胞のCRISPR編集は、他のゲノム工学ツールに対していくつかの利点を提供します。これらには、gRNA配列の精度、目的の遺伝子を標的とするgRNAを設計する簡易性、高い遺伝子編集効率、および複数のgRNAを同時に使用できるため、複数の遺伝子を標的とする能力が含まれる。
具体的には、ここで説明する方法では、CRISPRガイドRNAとCas9をコードするレンチウイルスを用いて、T細胞のCAR伝達中に遺伝子を破壊した。CAR-T細胞を編集するための適切な手法を選択する際には、ここで説明する技術は、研究グレードのCAR-T細胞を生成する効率的なメカニズムであることを示唆していますが、Cas9をゲノムに永久的に統合する長期的な効果は不明であるため、この方法論は、概念実証研究グレードCAR-T細胞を開発するために提案するが、良好な製造実践グレードCAR-T細胞を製造するためのものではない。
特に、ヒトCD19を標的とする顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)ノックアウトCAR-T細胞の生成について説明する。これらのCAR-T細胞は、GM-CSF(遺伝子名CSF2)およびCas9に特異的なガイドRNAをコードするレンチウイルス粒子との伝達によって生成された。我々は以前、GM-CSF中和が異種移植片モデルでCRSおよびNTを改善することを見出した。12 GM-CSFk/o CAR-T細胞は、製造プロセス中のGM-CSFの阻害を可能にし、野生型CAR-T細胞と比較してCAR-T細胞抗腫瘍活性および生体内での生存を高めながら、GM-CSFの産生を効果的に減少させる。12このように、ここではCRISPR/Cas9編集CAR-Tセルを生成する方法論を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本報告では,CRISPR/Cas9技術を利用してCAR-T細胞に二次修飾を誘導する方法論について述べた.具体的には、目的の遺伝子を標的とするgRNAとCas9を含むウイルスベクターを用いてレンチウイルス伝達を用いてGM-CSFk/o CART19細胞を生成することが実証されている。我々は以前、GM-CSF中和が異種移植片モデルでCRSおよびNTを改善することを示した。12前述したように、GM-CSFk/o</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、K12CA090628(SSK)、国立総合癌ネットワーク(SSK)、メイヨークリニックセンター(SSK)、プレドリン財団(SSK)、メイヨークリニック実践局(SSK)の助成金を通じて支援されました。メイヨークリニック医療科学者養成プログラムロバートL.ハウエル医師-科学者奨学金(RMS)。
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
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