Summary

CAR-T सेल में जीएम-सीएसएफ को नॉक आउट करने के लिए CRISPR/Cas9 का उपयोग करना

Published: July 22, 2019
doi:

Summary

यहाँ, हम एक CRISPR/Cas9 प्रणाली के माध्यम से सीएआर-टी कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से संपादित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

Chimeric प्रतिजन रिसेप्टर टी (सीएआर-टी) सेल थेरेपी कैंसर के लिए एक अत्याधुनिक और संभावित क्रांतिकारी नए उपचार विकल्प है. हालांकि, कैंसर के उपचार में इसके व्यापक उपयोग की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। इन सीमाओं में साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम (सीआरएस) और न्यूरोटॉक्सिसिटी (एनटी) और सीमित विस्तार, प्रभावक कार्य, और ठोस ट्यूमर में एंटी-ट्यूमर गतिविधि जैसे अद्वितीय विषाक्तता का विकास शामिल है। सीएआर-टी कोशिकाओं की सीएआर-टी प्रभावकारिता और/या नियंत्रण विषाक्तता को बढ़ाने के लिए एक रणनीति सीएआर-टी सेल विनिर्माण के दौरान स्वयं सीएआर-टी कोशिकाओं के जीनोम को संपादित करना है। यहाँ, हम एक lentiviral निर्माण के साथ transduction के माध्यम से CAR-T कोशिकाओं में CRISPR/Cas9 जीन संपादन के उपयोग का वर्णन एक गाइड आरएनए दानेदार मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) और Cas9 युक्त. एक उदाहरण के रूप में, हम GM-CSF के CRISPR/Cas9 मध्यस्थता नॉकआउट का वर्णन करते हैं। हमने दिखाया है कि इन जीएम-सीएसएफk/o कार-टी कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से कम जीएम-सीएसएफ का उत्पादन करते हुए महत्वपूर्ण टी सेल समारोह को बनाए रखने और जंगली प्रकार सीएआर-टी कोशिकाओं की तुलना में विवो में बढ़ाया विरोधी ट्यूमर गतिविधि में परिणाम।

Introduction

Chimeric प्रतिजन रिसेप्टर टी (सीएआर-टी) सेल थेरेपी कैंसर के उपचार में महान वादा दर्शाती है. 1 , 2 दो कार-टी सेल चिकित्सा CD19 को लक्षित (CART19) हाल ही में संयुक्त राज्य अमेरिका में अनुमोदित किया गया और यूरोप में बहुकेंद्र नैदानिक परीक्षणों में हड़ताली परिणामों का प्रदर्शन करने के बाद बी सेल द्रोह में उपयोग के लिए. 3 , 4 , 5 सीएआर-टी कोशिकाओं के अधिक व्यापक उपयोग के लिए बाधाओं ठोस ट्यूमर में सीमित गतिविधि और साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम (सीआरएस) और neurotoxicity (NT) सहित जुड़े toxicities हैं। 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 सीएआर-टी सेल थेरेपी के चिकित्सीय सूचकांक को बढ़ाने के लिए, जीनोम इंजीनियरिंग उपकरण जैसे जस्ता उंगली न्यूक्लेस, टैलेन, और CRISPR कम विषाक्त या अधिक प्रभावी सीएआर-टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के प्रयास में सीएआर-टी कोशिकाओं को और संशोधित करने के लिए कार्यरत हैं। 10 , 11

इस आलेख में, हम CRISPR/Cas9 संपादित CAR-T कक्ष जनरेट करने के लिए एक विधि का वर्णन करें। इस विधि का विशिष्ट लक्ष्य कम विषाक्त या अधिक प्रभावी सीएआर-टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए CRISPR/Cas9 के माध्यम से सीएआर-टी सेल विनिर्माण के दौरान सीएआर-टी कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से संशोधित करना है। इस पद्धति को विकसित करने के लिए तर्क कार-टी सेल थेरेपी के नैदानिक अनुभव से सीखा सबक पर बनाया गया है, जो उपन्यास रणनीतियों के लिए एक तत्काल जरूरत को इंगित करता है कार-टी सेल थेरेपी की चिकित्सीय खिड़की बढ़ाने के लिए और में आवेदन का विस्तार अन्य ट्यूमर और क्लिनिक में प्रवेश करने के लिए शुरू कर दिया है कि कार-टी कोशिकाओं के कई संशोधनों की अनुमति सिंथेटिक जीव विज्ञान में हाल ही में अग्रिम द्वारा समर्थित है। जबकि कई जीनोम इंजीनियरिंग उपकरण विकसित किए जा रहे हैं और विभिन्न सेटिंग्स में लागू किए जा रहे हैं, जैसे जस्ता उंगली न्यूक्लेस, टैलेन, और CRISPR, हमारी कार्यप्रणाली में CAR-T कोशिकाओं के CRISPR/Cas9 संशोधन का वर्णन किया गया है। 10 , 11 CRISPR/Cas9 एक आरएनए आधारित जीवाणु रक्षा तंत्र है कि विदेशी डीएनए को खत्म करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. CRISPR एक गाइड आरएनए (GRNA) के माध्यम से पहचान की एक लक्ष्य अनुक्रम को छोड़ने के लिए endonucleases पर निर्भर करता है। CAR-T कोशिकाओं के CRISPR संपादन अन्य जीनोम इंजीनियरिंग उपकरणों पर कई फायदे प्रदान करता है. ये gRNA अनुक्रम की परिशुद्धता शामिल हैं, एक gRNA ब्याज के जीन को लक्षित डिजाइन करने के लिए सादगी, उच्च जीन संपादन दक्षता, और कई gRNAs के बाद से कई जीन को लक्षित करने की क्षमता एक ही समय में इस्तेमाल किया जा सकता है.

विशेष रूप से यहाँ वर्णित तरीकों में, हम टी कोशिकाओं के कार transduction के दौरान एक जीन को बाधित करने के लिए एक lentivirus एन्कोडिंग CRISPR गाइड आरएनए और Cas9 इस्तेमाल किया. कार-टी कोशिकाओं को संपादित करने के लिए एक उपयुक्त तकनीक का चयन करने में, हम सुझाव है कि यहाँ वर्णित तकनीक अनुसंधान ग्रेड सीएआर-टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक कुशल तंत्र है, लेकिन क्योंकि जीनोम में Cas9 के स्थायी एकीकरण के दीर्घकालिक प्रभाव अज्ञात है, हम अवधारणा अनुसंधान ग्रेड सीएआर-टी कोशिकाओं का सबूत विकसित करने के लिए इस पद्धति का प्रस्ताव है, लेकिन अच्छा विनिर्माण अभ्यास ग्रेड सीएआर-टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए नहीं।

विशेष रूप से, यहाँ हम दानेदार मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) नॉकआउट कार-टी कोशिकाओं मानव CD19 को लक्षित करने की पीढ़ी का वर्णन. इन कार-टी कोशिकाओं को lentiviral कणों जीएम-सीएसएफ (जीन नाम CSF2) और Cas9 के लिए विशिष्ट आरएनए एन्कोडिंग के साथ transduction द्वारा उत्पन्न किया गया. हमने पहले पाया था कि जीएम-सीएसएफ तटस्थीकरण एक विदेशी ग्राफ्ट मॉडल में सीआरएस और एनटी को सुधारता है। 12 जीएम-सीएसएफk/o कार-टी कोशिकाओं विनिर्माण प्रक्रिया के दौरान जीएम-सीएसएफ के निषेध के लिए अनुमति देते हैं, प्रभावी ढंग से जीएम-सीएसएफ के उत्पादन को कम करने, जबकि कार-टी सेल विरोधी ट्यूमर गतिविधि और वाइल्डटाइप सीएआर-टी कोशिकाओं की तुलना में विवो में अस्तित्व को बढ़ाने। 12 इस प्रकार, यहाँ हम CRISPR/Cas9 संपादित कार-टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं।

Protocol

यह प्रोटोकॉल मेयो क्लिनिक के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) के दिशानिर्देशों का पालन करता है। 1. CART19 सेल उत्पादन टी सेल अलगाव, उत्तेजना, और पूर्व vivo सं…

Representative Results

चित्र 1 जीएम-सीएसएफ के जीएम-सीएसएफ की कमी को दर्शाता है। यह सत्यापित करने के लिए कि टी कोशिकाओं के जीनोम को जीएम-सीएसएफ को नॉकआउट करने के लिए परिवर्तित किया गया था, टीईडी अनुक?…

Discussion

इस रिपोर्ट में, हम सीएआर-टी कोशिकाओं में द्वितीयक संशोधनों को प्रेरित करने के लिए CRISPR/Cas9 तकनीक का उपयोग करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं। विशेष रूप से, यह एक वायरल वेक्टर है कि gRNA ब्याज और Cas9 के जीन को ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम K12CA090628 (SSK), राष्ट्रीय व्यापक कैंसर नेटवर्क (SSK), व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए मेयो क्लिनिक केंद्र (SSK), Predolin फाउंडेशन (SSK), अनुवाद के मेयो क्लिनिक कार्यालय से अनुदान के माध्यम से समर्थित किया गया था अभ्यास करने के लिए (SSK), और मेयो क्लिनिक चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम रॉबर्ट एल हॉवेल चिकित्सक-वैज्ञानिक छात्रवृत्ति (आरएमएस).

Materials

CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience Invitrogen 17-0038-42
Choice Taq Blue Mastermix Denville Scientific C775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit  STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a  BD Pharmingen 555800
Fixation Medium (Medium A) Invitrogen GAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2
CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector:
pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number:
High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free
of charge)
GenScript N/A custom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
https://tide.nki.nl. Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience Invitrogen 47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Monensin Solution, 1000X BioLegend 420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 BD Pharmingen 559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 BD Pharmingen 561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 BD Pharmingen 560687
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Scientific 5100-0001
NALM6, clone G5  ATCC CRL-3273 acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free Water Promega P119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile Genesee Scientific 25-227
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile Genesee Scientific 25-228
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid Gibco 31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 BD Horizon 562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid Gibco 10378-016
Permeabilization Medium (Medium B) Invitrogen GAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini Kit Invitrogen K182001
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421 BD Horizon 562930
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

References

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Cite This Article
Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells. J. Vis. Exp. (149), e59629, doi:10.3791/59629 (2019).

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