Använda CRISPR/Cas9 för att slå ut GM-CSF i CAR-T-celler
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att genetiskt redigera CAR-T-celler via ett CRISPR/Cas9-system.
Abstract
Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cellterapi är en skäregg och potentiellt revolutionerande nya behandlingsalternativ för cancer. Det finns dock betydande begränsningar för dess utbredda användning vid behandling av cancer. Dessa begränsningar inkluderar utveckling av unika toxiciteter såsom cytokin release syndrome (CRS) och neurotoxicitet (NT) och begränsad expansion, effektor funktioner, och anti-tumör aktivitet i solida tumörer. En strategi för att förbättra bil-T effekt och/eller kontroll toxiciteter av bil-T-celler är att redigera genomet av bil-T-celler själva under bil-T cell tillverkning. Här beskriver vi användningen av CRISPR/Cas9 genredigering i CAR-T-celler via transduktion med en lentiviral konstruktion som innehåller en guide RNA till granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) och Cas9. Som ett exempel beskriver vi CRISPR/Cas9 medierad knockout av GM-CSF. Vi har visat att dessa GM-CSFk/o Car-T-celler effektivt producera mindre GM-CSF samtidigt bibehålla kritisk T-cells funktion och resultera i förbättrad anti-tumöraktivitet in vivo jämfört med vilda typ bil-t-celler.
Introduction
Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cellterapi uppvisar stora löfte vid behandling av cancer. 1 , 2 två bil-T cellterapier inriktning CD19 (CART19) godkändes nyligen i Förenade anges och i Europa för användning i B-cellmaligniteter efter att ha visat slående resultat i multicenter kliniska prövningar. 3 , 4 , 5 hinder för en mer utbredd användning av bil-T-celler är begränsad aktivitet i solida tumörer och tillhörande toxicitet inklusive cytokinfrigörarsyndrom (CRS) och neurotoxicitet (NT). 3 , ,5 , 6 , 7 , 8 , 9 för att förbättra det terapeutiska indexet för bil-t cellterapi, genom tekniska verktyg såsom zink finger nukleaser, talens, och CRISPR används för att ytterligare modifiera Car-t-celler i ett försök att generera mindre giftiga eller effektivare bil-t-celler. 10 , elva
I den här artikeln beskriver vi en metod för att generera CRISPR/Cas9 redigerade CAR-T-celler. Det specifika målet med denna metod är att genetiskt modifiera CAR-T-celler under bil-T cell tillverkning via CRISPR/Cas9 för att generera mindre giftiga eller effektivare bil-T-celler. Den logiska grunden för att utveckla denna metod bygger på lärdomar från klinisk erfarenhet av bil-T cellterapi, vilket tyder på ett brådskande behov av nya strategier för att öka det terapeutiska fönstret av bil-T cellterapi och att utvidga tillämpningen till andra tumörer och stöds av de senaste framstegen inom syntetisk biologi tillåter flera modifieringar av bil-T-celler som har börjat komma in i kliniken. Medan flera arvs tekniska verktyg utvecklas och appliceras i olika miljöer, såsom zinkfingernukleaser, TALENs och CRISPR, beskriver vår metodik CRISPR/Cas9 modifiering av CAR-T-celler. 10 , 11 CRISPR/Cas9 är en RNA-baserad bakteriell försvarsmekanism som är utformad för att eliminera främmande DNA. CRISPR förlitar sig på endonukleaser för att klyva en målsekvens som identifierats genom en guide RNA (gRNA). CRISPR-redigering av CAR-T-celler ger flera fördelar jämfört med andra genomtekniska verktyg. Dessa inkluderar precision i gRNA sekvens, enkelhet att utforma en gRNA inriktning genen av intresse, hög genredigering effektivitet, och förmågan att rikta flera gener eftersom flera gRNAs kan användas på samma gång.
Specifikt i de metoder som beskrivs här, vi använde en lentivirus kodning CRISPR guide RNA och Cas9 att störa en gen under bil transduktion av T-celler. Vid val av en lämplig teknik för att redigera bil-T-celler, föreslår vi den teknik som beskrivs här är en effektiv mekanism för att generera forskning grade CAR-T-celler, men eftersom den långsiktiga effekten av permanent integration av Cas9 i arvsmassan är okänd, vi föreslå denna metod för att utveckla bevis på begreppet forskning klass bil-T-celler men inte för att producera god tillverkningssed grade CAR-T-celler.
I synnerhet, här beskriver vi generering av granulocyt makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) knockout CAR-T-celler riktade mot Human CD19. Dessa CAR-T-celler genererades genom transduktion med lentivirala partiklar som kodar en guide RNA som är specifik för GM-CSF (gen namn CSF2) och Cas9. Vi fann tidigare att GM-CSF neutralisering Ameliorates CRS och NT i en xenograft modell. 12 GM-CSFk/o Car-t-celler möjliggör hämning av GM-CSF under tillverkningsprocessen, effektivt minska produktionen av GM-CSF samtidigt förbättra Car-t cell anti-tumör aktivitet och överlevnad in vivo jämfört med vildtyp bil-t celler. 12 således, här ger vi en metod för att generera CRISPR/CAS9 redigerade Car-T-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna rapport beskriver vi en metodik för att använda CRISPR/Cas9 teknik för att inducera sekundära modifieringar i CAR-T-celler. Specifikt, detta demonstreras med hjälp av lentiviral transduktion med en viral vektor som innehåller gRNA inriktning genen av intresse och Cas9 att generera GM-CSFk/o CART19 celler. Vi hade tidigare visat att GM-CSF neutralisering Ameliorates CRS och NT i en xenograft modell. 12 som tidigare beskrivits medger GM-CSFk/o Car-T-celler HÄMNIN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes genom bidrag från K12CA090628 (SSK), National omfattande cancer Network (SSK), Mayo Clinic Center för individualiserad medicin (SSK), den Predolin Foundation (SSK), Mayo Clinic Office of Translation till Practice (SSK), och den Mayo Clinic medicinsk vetenskapsman utbildningsprogram Robert L. Howell läkare-forskare stipendium (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
- Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
- Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
