Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Utforske sekvens plass til å identifisere bindende områder for regulatoriske RNA-binding proteiner

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59635
Automatic Translation
1
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

Summary

Sekvens spesifisitet er avgjørende for gen regulering. Regulatoriske proteiner som gjenkjenner spesifikke sekvenser er viktig for gen regulering. Definere funksjonelle bindende områder for slike proteiner er et utfordrende biologisk problem. En gjentakende tilnærming for identifisering av et bindings sted for et RNA-bindende protein er beskrevet her, og gjelder for alle RNA-bindende proteiner.

Abstract

Gen regulering spiller en viktig rolle i alle celler. Transcriptional, post-Transcriptional (eller RNA prosessering), translational, og post-translational trinn brukes til å regulere spesifikke gener. Sekvens spesifikke nukleinsyre yre-bindende proteiner mål bestemte sekvenser for å kontrollere romlige eller timelige genuttrykk. Innbindingen steder inne nukleinsyre syren er karakteristisk kjennetegnet av mutational analyse. Men mange proteiner av interesse har ingen kjent bindende nettsted for slik karakterisering. Her beskriver vi en metode for å identifisere tidligere ukjente bindings områder for RNA-bindende proteiner. Det innebærer gjentakende valg og forsterkning av sekvenser som starter med et randomisert sekvens utvalg. Etter flere runder med disse trinnene-transkripsjon, binding, og forsterkning-de beriket sekvenser er sekvensielt å identifisere en foretrukket bindende område (r). Suksessen til denne tilnærmingen er overvåket ved hjelp in vitro bindende analyser. Deretter kan in vitro og in vivo funksjonelle analyser brukes til å vurdere den biologiske relevansen til de valgte sekvensene. Denne tilnærmingen tillater identifisering og karakterisering av et tidligere ukjent bindende nettsted (er) for ethvert RNA-bindende protein som en analyse for å skille protein-bundet og ubundet RNAs eksisterer.

Introduction

I cellebiologi spiller gen regulering en sentral rolle. På ett eller flere trinn langs genuttrykk veien, har gener potensial til å bli regulert. Disse trinnene inkluderer transkripsjon (initiering, forlengelse, og oppsigelse) samt skjøting, polyadenylation eller 3 ' end formasjon, RNA eksport, mRNA oversettelse, og forfall/lokalisering av primære transkripsjoner. På disse trinnene, nukleinsyre acid-bindende proteiner modulere gen regulering. Identifisering av bindende områder for slike proteiner er et viktig aspekt ved å studere gen kontroll. Mutational analyse og Fylogenetiske sekvens sammenligning har blitt brukt til å oppdage regulatoriske sekvenser eller protein-bindende steder i nukleinsyre syrer, slik som arrangører, skjøte steder, polyadenylation elementer, og translational signaler1, 2 andre priser , 3 andre priser , firetil.

Pre-mRNA skjøting er en integrert trinn under genuttrykk og regulering. Flertallet av pattedyr gener, inkludert de hos mennesker, har introns. En stor brøkdel av disse transkripsjoner er alternativt skjøtes, produsere flere mRNA og protein isoformene fra samme genet eller primære transkripsjon. Disse isoformene har celle-spesifikke og utviklingsmessige roller i cellebiologi. Den 5 ' skjøte området, den grenen-punktet, og polypyrimidine-tarmkanalen/3 ' skjøte området er kritiske skjøting signaler som er underlagt regulering. I negativ regulering, en ellers sterk skjøte området er undertrykt, mens i positiv regulering en ellers svak skjøte nettstedet er aktivert. En kombinasjon av disse hendelsene gir en overflod av funksjonelt distinkte isoformene. RNA-bindende proteiner spiller nøkkelroller i disse alternative skjøting hendelser.

Tallrike proteiner er kjent hvis bindings sted (er) eller RNA-mål gjenstår å identifiseres som5,6. Linking regulatoriske proteiner til deres nedstrøms biologiske mål eller sekvenser er ofte en kompleks prosess. For slike proteiner, identifisering av deres mål RNA eller bindende nettsted er et viktig skritt i å definere sine biologiske funksjoner. Når et bindende nettsted er identifisert, kan det videre karakteriseres ved hjelp av standard molekylær-og biokjemiske analyser.

Tilnærmingen er beskrevet her har to fordeler. For det første kan det identifisere et tidligere ukjent bindings område for et protein av interesse. For det andre er en ekstra fordel med denne tilnærmingen at den samtidig tillater metnings mutagenese, som ellers ville være arbeidsintensiv for å få sammenlignbar informasjon om sekvens krav innenfor bindings området. Dermed tilbyr det en raskere, enklere og mindre kostbart verktøy for å identifisere protein bindende områder i RNA. Opprinnelig ble denne tilnærmingen (SELEX eller systematisk evolusjon av ligander ved eksponentiell berikelse) brukt til å karakterisere bindings stedet for bakteriofag T4 DNA-polymerase (genet 43 protein), som overlapper med ribosom bindings sted i sin egen mRNA. Bindings området inneholder en 8-base løkke sekvens som representerer 65 536 randomiserte varianter for analyse7. For det andre var tilnærmingen også selvstendig brukes til å vise at bestemte bindende nettsteder eller aptamers for ulike fargestoffer kan velges fra en pool av ca 1013 sekvenser8. Faktisk har denne tilnærmingen blitt bredt brukt i mange forskjellige sammenhenger for å identifisere aptamers (RNA eller DNA-sekvenser) for å binde mange ligander, slik som proteiner, små molekyler og celler, og for katalyse9. Som et eksempel kan en aptamer diskriminere mellom to xantin derivater, koffein og teofyllin, som avviker ved tilstedeværelsen av en methyl gruppe i koffein10. Vi har mye brukt denne tilnærmingen (SELEX eller gjentakende utvalg-forsterkning) for å studere hvordan RNA-binding proteiner fungerer i skjøting eller skjøting regulering11, som vil være grunnlaget for diskusjonen nedenfor.

Den tilfeldige biblioteket: vi brukte et tilfeldig bibliotek med 31 nukleotider. Lengden hensynet til tilfeldige biblioteket var løst basert på ideen om at den generelle skjøting faktor U2AF65 binder seg til en sekvens mellom gren-punktet sekvens og 3 ' skjøte området. I gjennomsnitt er avstanden mellom disse skjøting signalene i Metazoer i størrelsesklasse 20 til 40 nukleotider. En annen protein sex-lethal var kjent for å binde seg til en dårlig preget regulatoriske sekvensen nær 3 ' skjøte stedet for sitt mål pre-mRNA, transformator. Derfor valgte vi en tilfeldig region av 31 nukleotider, flankert av primer bindende områder med begrensning enzym områder for å muliggjøre PCR forsterkning og feste av T7 RNA polymerase promoter for in vitro transkripsjon. Den teoretiske biblioteket størrelse eller kompleksitet var 431 eller ca 1018. Vi brukte en liten brøkdel av dette biblioteket for å forberede våre tilfeldige RNA Pool (~ 1012-1015) for eksperimentene beskrevet nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: figur 1 inneholder et sammendrag av de viktigste trinnene i prosessen med gjentatt valg-forsterkning (SELEX).

1. generering av en tilfeldig biblioteksmal

  1. Syntetisere fremover primer 5 '- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3 ' og omvendt PRIMER 5 '-GCGACGGATCCAAGCTTca-3 ' av kjemisk syntese på en DNA-synthesizer.
    Merk: den primere og det tilfeldige biblioteket kan være syntetisert kommersielt.
  2. Syntetisere et tilfeldig bibliotek oligonukleotid mal 5 '-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N1... N31) TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3 ' av kjemisk syntese. Bruk en ekvimolare blanding av fire phosphoramidites under syntese for de 31 randomiserte posisjoner vist ovenfor som N.
    Merk: sekvensen av biblioteket malen inneholder 31 tilfeldige nukleotider (N1 til N31) og flankerer sekvenser for binding av fremover og revers primere. The Forward primer inkluderer T7 RNA polymerase promoter sekvens (understreket) for in vitro transkripsjon og en restriksjon site Bcl1 (kursiv) for kloning. Omvendt primer inneholder restriksjon enzym områder BamH1 og HindIII (kursiv) for å lette kloning.

2. generering av DNA tilfeldig bibliotek Pool

  1. Fest T7 RNA-polymerase til biblioteket ved polymerase kjedere reaksjon (PCR) som inneholder en tilfeldig biblioteksmal på 1 μM DNA, 1 μM av hver primer, 20 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mm KCl, 0,1 μg/μL acetylert storfe serum albumin, 2 enheter av Taq < /C1 > polymerase og 200 μM hver av dNTPs (deoxyguanosine, deoksyadenosinregionen, deoxycytidine og deoksytymidinmolekylene trifosfat).
  2. Bruk fem sykluser med denaturering, annealing og forlengelses trinn (94 ° c i 1 min, 53 ° c i 1 min, og 72 ° c i 1 min) av PCR etterfulgt av en syklus av forlengelse (72 ° c i 10 min).

3. syntese av Pool 0 RNA

  1. Sett opp en 100 μL transkripsjon reaksjon12. Bland T7 transkripsjon buffer, 1 μM tilfeldig bibliotek Pool DNA, 5 mM dithiotreitol (DTT), 2 mM guanosin trifosfat (GTP), 1 mM hver av adenosin trifosfat (ATP), cytidinanaloger trifosfat (CTP), og uridindifosfatglukuronosyltransferase trifosfat (UTP), og 2 enheter/μL T7 RNA polymerase.
    Merk: RNA kan kopieres in vitro ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett med en opsjon på T7-eller SP6 RNA-polymerase.
  2. Ruge over reaksjonsblandingen i et mikrosentrifugen rør for 2 timer ved 37 ° c.
  3. Gel rense RNA i en 10% denaturering polyakrylamid gel.
  4. Identifiser plasseringen av transkripsjoner på gelen ved farging den med metylen blå eller autoradiografi ved å inkludere spor av radioaktivitet (0,5 μL eller mindre av α-32P UTP) i transkripsjon reaksjonen.
    1. Plasser gel skive i et sentrifugerør og bryte inn i mindre biter, for eksempel, med en homogenisator spissen. Legg til proteinase K (PK) buffer (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 12,5 mM EDTA, 1% natrium natriumdodecylsulfat sulfat) å dyppe gel stykker. La røret på en nutator fra 2 t til natten ved romtemperatur.
  5. Snurr i en høyhastighets mikrosentrifugen (14 000 RPM eller 16 873 x g) i 5 minutter ved romtemperatur for å fjerne gel rusk og gjenopprette bufferløsningen.
  6. Vortex prøven to ganger med samme volum av fenol-kloroform og en gang med kloroform.
  7. Bland den vandige fasen ovenfra med en tiende bind av natrium acetate (3,0 M, pH 5,2), 10 mikrogram tRNA eller 20 μg av glykogen og etanol (2 – 3 volumer, lagret ved-20 ° c). La rørene ligge ved-80 ° c i 1 time.
  8. Snurr rørene som inneholder oppløsningen i 5 – 10 min ved 4 ° c i en mikrosentrifugen (14 000 RPM eller 16 873 x g). Kast supernatanten forsiktig. Skyll RNA-pellet-en med 70% etanol og spinn i 2 – 5 min. aspirer etanol nøye. Luft tørker RNA-pellet-en.
  9. Solubilize av RNA-pellet-en i 50 av vann som behandles med dietyl pyrocarbonate (DEPC). Behold prøven ved-20 ° c for lagring.
    Merk: rens RNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige spin-kolonner, som for tiden er mer vanlig brukt til å fjerne radioaktivitet og fungere som et raskt og mer praktisk alternativ for RNA-rensing.
    FORSIKTIG: Bruk et skjold av akryl glass, hansker og andre forholdsregler for å beskytte mot radioaktivitet.

4. reaksjon på protein binding og separasjon av bundet RNA

  1. Utfør binding av protein og RNA i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 i et volum på 100 μL ved å legge til følgende ingredienser i disse endelige konsentrasjonene: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 μg/μL blod serum albumin, 0,5 enheter/μL RNasin, 0,15 μg/μL tRNA , 1 mM EDTA, og 30 μL av passende rekombinant protein (PTB) konsentrasjon. Legg til RNA fra det aktuelle bassenget.
    Merk: skjøting faktor U2AF65 vanligvis binder seg til polypyrimidine-tarmkanalen/3 ' skjøte steder av modell introns med en bindende affinitet (likevekt dissosiasjon konstant eller Kd) på ca 1-10 nM. Derfor, de to første rundene av binding brukt proteinkonsentrasjon 10-fold over Kd for U2AF65; for SXL-og PTB-proteiner var Start konsentrasjonen i dette området bare vår beste gjetning. Dette sørget for at ønskede RNA-arter som kan binde, selv om lavere affinitet sekvenser også potensielt bundet. I runder 3 og 4 (transkripsjon, binding, og forsterkning), protein konsentrasjonen ble redusert tre ganger (trinn 4,1). Dette ble gjort for å suksessivt eliminere lav affinitet RNA arter.
  2. Plasser rørene som inneholder bindende reaksjoner i ca 30 min ved 25 ° c i en temperatur blokk (eller på is).
  3. Fractionate den bundne RNA-en fra den ubundne RNA-en for de 4 første omg med valg-forsterkning ved hjelp av følgende trinn.
    1. Filtrer prøven (100 μL) ved romtemperatur gjennom et nitrocellulose filterfestet til et vakuum manifold.
      Merk: RNA-protein-komplekset, men ikke den ubundne RNA-en, forblir på filteret.
    2. Hakk filteret med beholdt RNA i fragmenter med et sterilt barberblad; inn i et sentrifugerør. Recover RNA ved risting røret forsiktig for minimum 3 t (eller over natten) med filter brikker nedsenket i proteinase K (PK) buffer.
    3. Deproteinize RNA-prøven ved å virvlingen den i nærvær av et likt volum av fenol-kloroform (1:1) og deretter av kloroform. Gjenopprett den vandige fasen hver gang ved å sentrifugering prøven ved høy hastighet i 5 minutter ved romtemperatur.
    4. Bland det med natrium acetate (0,1 volum på 3,0 M, pH 5,2) og etanol (2 – 3 bind av absolutt etanol, 200 bevis). La slangen i en-80 ° c fryser i 30 min, sentrifuger den i høy hastighet i 10 min, og, etter vask og tørking trinn (trinn 3,8), solubilize RNA i vann behandlet med DEPC. Disse trinnene er beskrevet ovenfor (trinn 3,6 til 3,9).
  4. Skill de protein bundne RNA-fraksjonene fra de ubundne fraksjonene for de siste 2 rundene (runder 5 og 6; transkripsjon, binding og forsterkning) som følger. Reduser protein konsentrasjonen i bindende reaksjonen (trinn 4,1) ved ytterligere tre-fold for ytterligere valg press for å berike høy affinitet bindende sekvenser og fortrinnsvis fjerne lav affinitet sekvenser.
    1. Pre-cast en innfødt polyakrylamid gel (5% med 60:1 akrylamid: BIS-akrylamid ratio) i 0,5 x TBE buffer (Tris-borate-EDTA) før du setter opp ovenfor RNA: protein-binding (trinn 4,1) reaksjon. Electrophorese denne gelen i et kaldt rom (4 ° c) ved å påføre 250 V i 15 min.
    2. Pipetter over RNA: protein bindende reaksjoner (trinn 4,1) til forskjellige brønner av denne gelen.
      Merk: proteinet lagres ved-80 ° c og fortynnes før bruk i 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic acid (HEPES), pH 8,0, 20% glyserol, 0,2 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), 0,05% NP-40, og 1 mM dithiotreitol (DTT). Tillegg av 0,5-1,0 mM protease inhibitor phenylmethane sulfonyl fluor (PMSF) er valgfritt. I bindende reaksjon, bidrar denne bufferen ca 6% glyserol, som tillater direkte lasting av prøver i brønnene uten behov for å blande dem med en egen gel-lasting buffer.
    3. Fractionate den bundne RNA-en fra den ubundne RNA-en ved hjelp av gel-elektroforese i et kaldt rom (4 ° c) ved 250 V for 1 til 2 timer. Denne prosessen er også kjent som gel mobilitet Shift-analysen.
      Merk: varigheten av elektroforese varierer avhengig av funksjonene i RNA og protein som brukes til binding.
    4. Utsett gelen for en røntgen film og Identifiser plasseringen til den bundne RNA-en ved hjelp av autoradiografi. Klipp ut gel-stykket med den bundne RNA-en og sett den inn i et rør.
    5. Ruge den knuste gel Slice i PK buffer brukes til eluering for 3 t eller over natten.
    6. Gjenta trinn 3,5 til 3,9 beskrevet ovenfor. Kort sagt, Vortex den eluert RNA prøven kraftig først med fenol-kloroform og deretter med kloroform.
    7. Bland natrium acetate og etanol med den vandige fase etter kloroform ekstraksjon. Etter inkubasjons i-80 ° c fryser, snurr ved 4 ° c i 5 – 10 min for å samle RNA-pellet. Vask RNA pellet med etanol og lufttørke den ved å la lokket på røret åpent. Løs opp RNA i vann som behandles med DEPC.
      Merk: bytte til gel mobilitet Shift-analysen for fraksjonering tillater eliminering av uønskede RNA arter som kan ha blitt beriket for binding, for eksempel til nitrocellulose filteret her (eller en matrise) som brukes i de første rundene for fraksjonering.

5. omvendt transkripsjon og PCR forsterkning

  1. Syntetisere cDNA fra den oppløste RNA-en ved hjelp av omvendt transkriptase og omvendt primer ved å incubating 20 μL-reaksjonen (2 μL av 10x RT buffer, 2 μL av AMV revers transkriptase, 1 μM omvendt primer, 10 μL av RNA, RNase-hemmer valgfritt) ved 42 ° c for 60 min.
  2. Forsterk cDNA med 20 – 25 PCR-sykluser som beskrevet i trinn 2,1.

6. transkripsjon og protein bindende

  1. Gjenta prosessen med RNA-syntese, proteinbinding, separasjon av protein bundet og ubundet brøk, som beskrevet i avsnitt 3 – 5 ovenfor.

7. analyse av RNA-protein interaksjoner

  1. Bruk Forskyvnings analysen for gel-mobilitet (trinn 4,4) eller filter bindings analysen (trinn 4,3) for å bestemme bindings affinitet og spesifisitet for utvalgte bassenger eller individuelle sekvenser i hvert utvalg (se trinn 8,3).
  2. Bruk autoradiografi eller et fosfor imager for å oppdage og kvantifisere bånd i den bundne fraksjonen og ubundet brøk.

8. kloning og sekvenser

  1. Fordøye det endelige PCR-DNA-produktet med Begrensnings enzymer Bcl1 og HindIII for 1 – 2 timer, ombinde med riktig fordøyd pGEM3 eller andre plasmider som frakter Begrensnings nettstedene fra 2 t til over natten, gjør ligation produktet om til kompetente bakterieceller ved varme sjokk eller electroporation ved hjelp av standard molekylærbiologi prosedyrer13.
  2. Dyrke bakterier over natten ved å plating de transformert cellene på agar plater med Luria-Bertani (LB) medium og Ampicillin (50 μg/mL) ved 37 ° c. Plukk kolonier til vaksinere kultur rør som inneholder LB flytende medium med Ampicillin og vokse ved 37 ° c i en risting inkubator over natten. Rens plasmider DNAs som inneholder DNA-innsatser ved hjelp av en standard plasmider isolasjons protokoll13.
    Merk: kommersielle kits er tilgjengelig for plasmider rensing.
  3. Sekvens plasmider med DNA innsatser ved hjelp av dideoxy kjeden oppsigelse sekvensering protokollen, følgende produsentens instruksjoner for sekvensering14.
    Merk: sekvensering kan utføres i huset eller gjøres kommersielt.

9. sekvens justering

  1. Juster sekvenser og få en konsensus bindings område (r) ved hjelp av tilgjengelige elektroniske justeringsverktøy
    (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Følgende observasjoner viser vellykket valg-forsterkning (SELEX). Først analyserte vi Pool 0 og de valgte sekvensene for binding til proteinet som brukes for den gjentakende markeringen-forsterknings tilnærmingen. Figur 2 viser at pattedyr polypyrimidine-tarmkanalen bindende PROTEIN (PTB) viser knapt synlig binding til bassenget 0 sekvensen, men høy affinitet for den valgte sekvensen bassenget. Det var knapt synlig binding til pool 0 når vi brukte ca 300-fold høyere proteinkonsentrasjon for binding enn brukt for den valgte bassenget. Dermed var det minst en flere hundre ganger forskjell i protein bindende slektskap mellom tilfeldig eller starter bassenget og den valgte bassenget. Denne observasjons eksperimentelt bekrefter at utvalgs forsterknings protokollen som beskrives her, er vellykket.

For det andre har vi sekvensielt det valgte bassenget og bestemt et konsensus bindende nettsted. Konsensus sekvensen innhentet fra justering av flertallet av utvalgte sekvenser fra pattedyr PTB-valgte bassenget var: GCCUG (Y/G) UGCYYYYCYYYG (Y/G) CCC. Dette viser at vi har valgt unike pyrimidin-rike sekvenser som binder PTB11. Når vi utførte gjentatt valg-forsterkning for RNA-binding domenet til Drosophila PTB, BERIKET vi Cu-rike sekvenser avbrutt av guanosines. Blant de høye affinitet sekvenser at Drosophila PTB valgt var en 84% pyrimidin-rik SEKVENS: GCUUUCCUCUGUCGCCCUUCUUCGUCCCCUG. Faktisk er denne sekvensen ligner på pyrimidin-rik sekvens stede i Alpha-Tropomyosin Intronets opprinnelse som binder med høy affinitet til og er regulert av pattedyr PTB15. Vi har med hell brukt denne tilnærmingen gjentatte ganger for å studere RNA-binding egenskaper og funksjoner skjøting regulatorer og en skjøting faktor11,15,16. Tabell 1 viser vellykkede eksempler på RNA-bindende PROTEINER som SELEX ble brukt til å identifisere deres foretrukne eller konsensus bindende nettsted (er).

Tredje, en in vitro skjøting analysen, som er basert på alternative 3 ' skjøte nettstedvalg, viser funksjonell relevans av distinkte, men overlappende RNA-binding særegenheter av polypyrimidine-tarmkanalen bindende proteiner. Mens en oppstrøms 3 ' skjøte nettstedet brukes som standard, tillegg av rekombinant PTB fører til aktivering av alternative eller nedstrøms 3 ' skjøte nettsted (Figur 3). I kontrast tillegg av rekombinant hnRNP C17 fører til undertrykkelse av både 3 ' skjøte nettsteder. Tilsetting av rekombinant generelle skjøting faktor U2AF65 reverserer hnRNP C1-mediert 3 ' skjøte nettsted undertrykkelse (Figur 3) samt PTB-mediert effekt på nedstrøms 3 ' skjøte nettstedet aktivering (data ikke vist). En enkel forklaring på disse effektene er en direkte konkurranse mellom bindingen av den generelle skjøte faktor U2AF65 og PTB (også kalt hnRNP I), som fortrinnsvis binder seg til og fortrenger visse 3 ' skjøter steder, eller mellom U2AF65 og hnRNP C, som binder seg til og fortrenger begge 3 ' skjøte nettsteder.

Figure 1
Figur 1: oppsummering av viktige trinn i gjentatt valg-forsterknings prosess (SELEX). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: berikelse av PTB-bindende RNAs. Økende konsentrasjon (fylt trekanter) av rekombinant PTB ble brukt med enten radiolabeled Pool 0 RNA eller den valgte bassenget innhentet følgende seks runder med valg og forsterkning. Plasseringen av ubundet RNA og RNA: protein-kompleks angis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjøte området veksling analysen validerer distinkte bindende særegenheter av pyrimidin-binding proteiner. (A-topp) Skjematisk av skjøting substrat. Den skjøting substrat inneholder en 5 ' skjøte nettsted og to alternative 3 ' skjøte nettsteder flankerer Intronets opprinnelse. Rektangler (åpne, med vannrette linjer og heltrukne) er exoner, og linjen er en Intronets opprinnelse. (A-nederst) hnRNP C1 fortrenger oppstrøms 3 ' skjøte nettsted (uten aktivering av nedstrøms 3 ' skjøte området), mens PTB fører til aktivering av nedstrøms 3 ' skjøte området. Den skjøting underlaget ble inkubert i en HeLa celle kjernefysisk ekstrakt. Den skjøting produkter (vist på sidene) ble analysert ved hjelp av en primer forlengelse analysen18 med skjøte-Junction primere (piler), som anerkjenner skjøting av felles 5 ' skjøte stedet til enten oppstrøms eller nedstrøms 3 ' skjøte området. (B) rekombinant U2AF65 (rU2AF65) reverserer den undertrykkende effekten av hnRNP C1. Tilsetting av rekombinant hnRNP C1, PTB, eller rU2AF65 proteiner til skjøting reaksjonen er indikert med + symboler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protein Foretrukket sekvens (er)
U2AF65 U-rik som inneholder CS
Sxl U-rik inneholder 2-4 GS
Ptb UCUUC-rik med noen GS
hnRNP C1 U-rik (5-6 lang)
CstF64 GU-Rich
hnRNP E1/E2 og K C-rik
U2AF65/U2AF35 heterodimer UUUYYYYUNUAGGU

Tabell 1: foretrukne bindings områder for enkelte RNA-bindende proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nukleinsyre acid-bindende proteiner er viktige regulatorer av dyre-og plante utvikling. Et viktig krav for SELEX prosedyren er utviklingen av en analyse som kan brukes til å skille protein-bundet og ubundet RNA fraksjoner. I prinsippet kan denne analysen være en in vitro bindende analysen som filter-bindende analysen, gel mobilitet Shift-analysen, eller en matrise bindende analysen19 for rekombinant proteiner, renset proteiner, eller protein komplekser. Analysen kan også være en enzymatisk analysen der prekursorer og produkter (eller viderekommende) kan skilles basert på størrelse eller annen måte20.

Mens mutagenese har vært mye brukt til å karakterisere bindende områder for proteiner, er det arbeidskrevende, og tidkrevende og lengre sekvenser er ikke så lett mottagelig for metning mutagenese. Betydningen av den repeterende bindingen og forsterkning tilnærmingen beskrevet her er at ikke bare gjør det overvinne noen av de ovennevnte begrensningene, kan det viktigst identifisere tidligere ukjente bindende områder og gi viktig informasjon om nukleotid krav i hver posisjon samtidig.

En viktig faktor for å lykkes med gjentakende valg-forsterkning er bindende affinitet og spesifisitet. Vanligvis, 12 til 15 runder med valg-forsterkning er ansatt og en sekvens plass på 1012 til 1015 molekyler kan rutinemessig samplet. Fremdriften og eventuell suksess av utvalget-forsterkning protokollen kan overvåkes ved hjelp av en bindende analysen eller direkte sekvensering, som overvåker affinitet for eller berikelse av bestemte sekvenser i mellomliggende bassenger, henholdsvis. Mens bindingen analysen ble tradisjonelt brukt, advent av neste generasjon sekvensering tillater analyse av sekvensen berikelse på måter ikke mulig ved manuell sanger sekvensering14.

Et kritisk skritt i suksessen til SELEX er fold berikelse av de ønskede molekylene på hvert trinn. Antall sykluser som kreves for SELEX varierer og avhenger av flere faktorer. For eksempel, hvis fold-berikelse av ønsket eller spesifikke sekvenser er høyere i hver runde, færre runder vil være tilstrekkelig. Men hvis en analyse tillater en høy andel av uønskede sekvenser i den bundne bassenget, vil ytterligere runder bli nødvendig for å berike ønsket RNA sekvenser. En begrensning av teknikken eller en utilsiktet konsekvens av behovet for ytterligere sykluser av utvalg-forsterkning som må holdes i bakhodet er muligheten for at det kan innføre gjenstander eller berike sekvenser som har urelaterte egenskaper som deres evne til å forsterke. Til slutt, mens noen programmer drar nytte av de høyeste affinitet bindemidler, for annen bruk, en balanse må bli truffet under valg-forsterkning prosessen mellom bindende affinitet og funksjon fordi tettest bindende sekvenser kanskje ikke nødvendigvis være de mest funksjonelle sekvenser i biologiske sammenhenger (f. eks, hvis en sekvens er gjenkjent flere ganger av forskjellige proteiner under skjøting).

Blant modifikasjoner og feilsøking for å forbedre prosedyren, negative valg eller motvirke valg kan anvendes for å øke spesifisitet. Tilsvarende bruk av ulike partisjonering protokoller, for eksempel filter binding analysen etterfulgt av gel mobilitet Shift-analysen, kan eliminere berikelse av uønskede sekvenser som binder, for eksempel til nitrocellulose filter eller en kolonne matrise21. Gitt at proteiner-nukleinsyre yre interaksjoner har både spesifikke og ikke-spesifikke komponenter, buffer forhold som salt og pH har effekter på RNA-protein interaksjoner. Videre kan bruk av passende proteinkonsentrasjon ha en direkte effekt på bevaring av sterke, svake og ikke-spesifikke bindemidler. Utvalgs trykk kan økes i suksessive runder, for eksempel ved å inkludere en konkurrent RNA, redusere proteinkonsentrasjon, eller redusere tiden for inkubasjons. Derfor, nøye betraktninger og optimalisere disse parametrene kan påvirke utfallet av SELEX protokollen.

I den seneste tid, mange variasjoner eller modifiseringer av originalen SELEX protokollen ha blitt bebygget hvilke seire over noen av begrensningene omtalte over. Disse inkluderer høy gjennomstrømning-SELEX (HT-SELEX), som kombinerer SELEX og massivt parallell sekvensering6, RNAcompete, som innebærer inkubasjons med overflødig ikke-tilfeldig RNA, pull-ned av bundet RNA, fluorescerende merking av RNA, og analyse på Microarrays5, RNA bind-n-SEQ, som kombinerer RNA affinitet analyse i en kvantitativ og høy gjennomstrømming mote22, og Rapid-SELEX, som forkorter prosessen og inkluderer en ikke-forsterkning trinn23.

Kjemisk modifiserte baser har blitt brukt til å utvide repertoaret av RNA molekyler for spesifikke applikasjoner24. Diagnostikk, legemiddel, samt molekyler med katalysator er blant de mange anvendelser (inkludert i medisin) av de utvalgte molekylene25. Aptamers utfyller antistoffer-baserte protokoller og gir utmerket verktøy hvis potensial, for eksempel i diagnostikk, legemiddel, og andre programmer, fortsatt å være fullt utnyttet26,27,28. I fremtiden, for eksempel kliniske fordeler er blant de mange ønskede programmer, utover hva den første FDA-godkjente aptamer (Pegaptanib natrium) kan levere for alder-relaterte makulaødem degenerasjon. Den skalerbare Proteomikk teknologien for protein målinger gir et skritt mot å forstå helse og sykdommer24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren erklærer at han ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatteren takker National Institutes of Health for tidligere finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
Glass Plates Standard Standard
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
polyacrylamide gel solutions Standard Standard
Proteinase K NEB P8107S
Recombinant PTB Laboratory Preparation Not applicable
Reverse Transcriptase NEB M0277S
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films Standard Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
  2. Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
  3. Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
  4. Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
  5. Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
  6. Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  9. Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
  10. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  11. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
  12. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
  14. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  15. Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
  16. Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
  17. Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
  18. Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
  19. Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
  20. Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
  21. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  22. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  23. Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).
  24. Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
  25. Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
  26. Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  27. Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
  28. Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).

Tags

Genetikk RNA-bindende protein gjentakende utvalg forsterkning skjøting polypyrimidine-skrift/3 ' skjøte site SELEX sekvens evolusjon i et reagensrør
Utforske sekvens plass til å identifisere bindende områder for regulatoriske RNA-binding proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, R. Exploring Sequence Space… More

Singh, R. Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins. J. Vis. Exp. (150), e59635, doi:10.3791/59635 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter