Summary
Sequentie specificiteit is essentieel voor genregulatie. Regelgevende eiwitten die specifieke sequenties herkennen zijn belangrijk voor genregulatie. Het definiëren van functionele binding sites voor dergelijke eiwitten is een uitdagend biologisch probleem. Een iteratieve benadering voor de identificatie van een bindingsplaats voor een RNA-bindend eiwit wordt hier beschreven en is toepasbaar op alle RNA-bindende eiwitten.
Abstract
Genregulatie speelt een belangrijke rol in alle cellen. Transcriptionele, post-transcriptionele (of RNA processing), translationele en post-translationele stappen worden gebruikt om specifieke genen te reguleren. Sequentie-specifieke nucleïnezuur-bindende eiwitten targeten specifieke sequenties om ruimtelijke of temporele genexpressie te beheersen. De binding sites in nucleïnezuren worden meestal gekenmerkt door mutationele analyse. Echter, talrijke eiwitten van belang hebben geen bekende binding site voor dergelijke karakterisering. Hier beschrijven we een aanpak om eerder onbekende binding sites te identificeren voor RNA-bindende eiwitten. Het gaat om iteratieve selectie en versterking van sequenties beginnend met een gerandomiseerde sequentie pool. Na een aantal rondes van deze stappen-transcriptie, binding en amplificatie-worden de verrijkte sequenties geordend om een voorkeurs binding site (s) te identificeren. Succes van deze aanpak wordt bewaakt met behulp van in vitro bindende assays. Vervolgens kunnen in vitro en in vivo Functionele assays worden gebruikt om de biologische relevantie van de geselecteerde sequenties te beoordelen. Deze aanpak maakt identificatie en karakterisering mogelijk van een eerder onbekende binding site (s) voor elk RNA-bindend eiwit waarvoor een test voor het scheiden van proteïne-gebonden en niet-afhankelijke Rna's bestaat.
Introduction
In celbiologie speelt genregulatie een centrale rol. Bij een of meerdere stappen langs het genexpressie traject hebben genen het potentieel om gereguleerd te worden. Deze stappen omvatten transcriptie (initiatie, rek en beëindiging), evenals splicing, polyadenylering of 3 ' end Formation, RNA export, mRNA vertaling, en verval/lokalisatie van primaire transcripten. Op deze stappen moduleren nucleïnezuur-bindende eiwitten genregulatie. Identificatie van bindende plaatsen voor dergelijke eiwitten is een belangrijk aspect van het bestuderen van gencontrole. De vergelijking van mutational analyse en fylogenetische sequentie is gebruikt om regelgevings sequenties of eiwit bindende locaties in nucleïnezuren te ontdekken, zoals promotors, Splice sites, polyadenylatie elementen en translationele signalen1, 2 , 3 , 4.
Pre-mRNA splicing is een integrale stap tijdens genexpressie en regulatie. Het merendeel van de zoogdier genen, ook bij mensen, heeft introns. Een groot deel van deze Transcripten is ook gesplitst, waardoor meerdere mRNA-en proteïne-isovormen uit hetzelfde gen of primaire transcript worden geproduceerd. Deze isovormen hebben celspecifieke en ontwikkelings rollen in de celbiologie. De 5 ' splice site, de tak-Point, en de polypyrimidine-Tract/3 ' splice site zijn kritische splicing signalen die onderworpen zijn aan regulering. In negatieve regulatie wordt een anderszins sterke Splice site onderdrukt, terwijl in positieve regulatie een anderszins zwakke Splice site wordt geactiveerd. Een combinatie van deze gebeurtenissen produceert een overvloed aan functioneel verschillende isoforms. RNA-bindende eiwitten spelen belangrijke rollen in deze alternatieve splicing-gebeurtenissen.
Er zijn talrijke eiwitten bekend waarvan de bindende plaats (en) of RNA-doelen nog steeds worden geïdentificeerd op5,6. Het koppelen van regelgevende eiwitten aan hun downstream biologische doelen of sequenties is vaak een complex proces. Voor dergelijke eiwitten is identificatie van hun doel RNA of bindingsplaats een belangrijke stap in het bepalen van hun biologische functies. Zodra een binding site is geïdentificeerd, kan deze verder worden gekarakteriseerd met behulp van standaard moleculaire en biochemische analyses.
De hier beschreven aanpak heeft twee voordelen. Ten eerste kan het een eerder onbekende binding site identificeren voor een eiwit van belang. Ten tweede, een bijkomend voordeel van deze aanpak is dat het tegelijkertijd verzadiging mutagenese toestaat, die anders arbeidsintensief zou zijn om vergelijkbare informatie te verkrijgen over de sequentie vereisten binnen de binding site. Zo biedt het een sneller, gemakkelijker en minder kostbaar hulpmiddel om eiwit bindende sites in RNA te identificeren. Oorspronkelijk werd deze aanpak (Selex of systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking) gebruikt om de bindingsplaats te karakteriseren voor de bacteriofaag T4 DNA polymerase (Gene 43 Protein), die overlapt met de ribosoom binding site in zijn eigen mRNA. De binding site bevat een 8-base lus reeks, die 65.536 gerandomiseerde varianten voor analyse7vertegenwoordigt. Ten tweede werd de benadering ook onafhankelijk gebruikt om aan te tonen dat specifieke bindingsplaatsen of aptamers voor verschillende kleurstoffen kunnen worden geselecteerd uit een pool van ongeveer 1013 sequenties8. In feite is deze aanpak in veel verschillende contexten algemeen gebruikt om aptamers (RNA-of DNA-sequenties) te identificeren voor het binden van talrijke liganden, zoals eiwitten, kleine moleculen en cellen, en voor katalyse9. Als voorbeeld kan een aptamer discrimineren tussen twee xanthinederivaten, cafeïne en theofylline, die verschillen door de aanwezigheid van één methylgroep in cafeïne10. We hebben deze aanpak uitgebreid gebruikt (SELEX of iteratieve selectie-amplificatie) om te bestuderen hoe RNA-bindende eiwitten functioneren in splicing of splicing Regulation11, die de basis zal zijn voor de discussie hieronder.
De Random Library: we gebruikten een willekeurige bibliotheek van 31 nucleotiden. De lengte overweging voor de Random Library was losjes gebaseerd op het idee dat de algemene splicing factor U2AF65 bindt aan een sequentie tussen de vertakkingspunt sequentie en de 3 ' splice site. Gemiddeld is de afstand tussen deze splicing signalen in figuur in het bereik van 20 tot 40 nucleotiden. Een ander eiwit geslacht-dodelijk was bekend om te binden aan een slecht gekarakteriseerde regelgevings sequentie in de buurt van de 3 ' splice site van zijn doelwit Pre-mRNA, transformator. Zo kozen we voor een willekeurige regio van 31 nucleotiden, geflankeerd door primer bindingsplaatsen met restrictie-enzym locaties om PCR-versterking en bevestiging van de T7 RNA polymerase Promoter voor in vitro transcriptie mogelijk te maken. De theoretische bibliotheek grootte of complexiteit bedroeg 431 of ongeveer 1018. We gebruikten een kleine fractie van deze bibliotheek om onze willekeurige RNA-pool voor te bereiden (~ 1012-1015) voor de hieronder beschreven experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: afbeelding 1 biedt een overzicht van de belangrijkste stappen in het iteratief selectie-amplificatie proces (Selex).
1. genereren van een willekeurige bibliotheeksjabloon
- Synthetiseren van de voorwaartse primer 5 '- GtaatacgactcactatagGGtgatcagattctgatcca-3 ' en de omgekeerde primer 5 '-GcgacGgatccaagcttca-3 ' door chemische synthese op een DNA-synthesizer.
Opmerking: de primers en de willekeurige bibliotheek kunnen commercieel worden gesynthetiseerd. - Synthetiseren van een willekeurige bibliotheek oligonucleotide sjabloon 5 '-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N1... N31) tgaagcttggatccgtcgc-3 ' door chemische synthese. Gebruik een equimolaire mengsel van vier fosforamidites tijdens de synthese voor de 31 gerandomiseerde posities zoals hierboven weergegeven als N.
Opmerking: de volgorde van de bibliotheeksjabloon bevat 31 willekeurige nucleotiden (N1 tot N31) en flankerende sequenties voor de binding van de voorwaartse en omgekeerde primers. De voorwaartse primer omvat de T7 RNA polymerase Promoter sequentie (onderstreept) voor in vitro transcriptie en een beperkings site Bcl1 (cursief) voor klonen. De omgekeerde primer bevat restrictie-enzym sites BamH1 en hindiii (cursief) om het klonen te vergemakkelijken.
2. generatie van de DNA Random Library pool
- Bevestig de T7 RNA polymerase promotor aan de bibliotheek door de polymerase kettingreactie (PCR) met 1 μM DNA Random Library template, 1 μM van elke primer, 20 mM tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mm kcl, 0,1 μg/μL geacetseerd runderserum albumine, 2 eenheden van Taq < /C1 > polymerase, en 200 μM elk van Dntp's (deoxyguanosine, deoxyadenosine, deoxycytidine en deoxythymidine trifosfaat).
- Gebruik vijf cycli denaturatie, gloeien en verleng stappen (94 °C gedurende 1 minuut, 53 °C gedurende 1 minuut en 72 °C gedurende 1 minuut) van PCR, gevolgd door één uitbreidings cyclus (72 °C gedurende 10 min).
3. synthese van pool 0 RNA
- Een 100 μL transcriptie reactie instellen12. Mix T7 transcriptie buffer, 1 μM Random Library pool DNA, 5 mm dithiotreïtol (DTT), 2 mm calciumguanosine trifosfaat (GTP), 1 mm elk van adenosinetrifosfaat (ATP), cytosinetrifosfaat trifosfaat (CTP) en Uridine trifosfaat (UTP), en 2 eenheden/μL T7 RNA polymerase.
Opmerking: RNA kan in vitro worden getranscribeerd met behulp van commercieel verkrijgbare kits met een optie van de T7 of SP6 RNA polymerase. - Inbroed het bovenstaande reactiemengsel in een micro centrifugebuis voor 2 uur bij 37 °C.
- Gel zuivert RNA in een 10% denaturerende polyacrylamidegel.
- Identificeer de locatie van de transcripten op de gel door deze te kleuring met methyleenblauw of autoradiografie door het opnemen van sporen van radioactiviteit (0,5 μL of minder van α-32P UTP) in de transcriptie reactie.
- Plaats de gelslice in een centrifugebuis en breek in kleinere stukjes, bijvoorbeeld met een homogenisator tip. Voeg de proteïnase K (PK) buffer (100 mm tris, pH 7,5, 150 mm NaCl, 12,5 mm EDTA, 1% natriumdodecylsulfaat) toe om de gelstukken onder te dompelen. Laat de buis op een nutator van 2 uur tot 's nachts bij kamertemperatuur.
- Spin in een High-Speed microcentrifuge (14.000 rpm of 16.873 x g) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het gelpuin te verwijderen en de bufferoplossing te herstellen.
- Vortex het monster twee keer met een gelijk volume fenol-chloroform en één keer met chloroform.
- Meng de waterige fase van bovenaf met een tiende volume Natriumacetaat (3,0 M, pH 5,2), 10 μg tRNA of 20 μg glycogeen en ethanol (2 – 3 volumes, opgeslagen bij-20 °C). Laat de buisjes bij-80 °C gedurende 1 uur.
- Draai de buisjes met de oplossing gedurende 5 – 10 minuten bij 4 °C in een micro centrifuge (14.000 rpm of 16.873 x g). Gooi het supernatant voorzichtig weg. Spoel de RNA pellet met 70% ethanol en spin voor 2 – 5 min. Aspirate ethanol zorgvuldig. Lucht drogen de RNA-pellet.
- Solubiliseer de RNA-pellet in 50 μL water behandeld met diethyl pyrocarbonaat (DEPC). Laat het monster bij-20 °C voor opslag.
Opmerking: Reinig het RNA met behulp van commercieel beschikbare spin kolommen, die momenteel vaker worden gebruikt om de radioactiviteit van het rechtsmiddel te verwijderen en dienen als een snel en handiger alternatief voor RNA-zuivering.
Let op: gebruik een acryl glas schild, handschoenen en andere voorzorgsmaatregelen ter bescherming tegen radioactiviteit.
4. eiwit bindende reactie en scheiding van gebonden RNA
- De binding van eiwitten en RNA in 10 mM tris-HCl, pH 7,5 in een volume van 100 μL door toevoeging van de volgende ingrediënten aan deze eindconcentraties: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 μg/μL boviene serumalbumine, 0,5 eenheden/μL Rnasine, 0,15 μg/μL tRNA , 1 mM EDTA en 30 μL geschikte recombinant-eiwitconcentratie (PTB). Voeg RNA toe vanuit de juiste pool.
Opmerking: de splicing factor U2AF65 bindt meestal aan de polyyrimidine-Tract/3 ' splice sites van model intron met een binding affiniteit (evenwichts dissociatieconstante of Kd) van ongeveer 1 – 10 nm. Daarom, de eerste twee rondes van binding gebruikte eiwitconcentratie 10-voudige boven de Kd voor U2AF65; voor SXL-en PTB-eiwitten was de start concentratie in dit bereik alleen onze beste schatting. Dit zorgde ervoor dat de gewenste RNA-soorten die konden binden, hoewel lagere affiniteit reeksen ook mogelijk gebonden. In rondes 3 en 4 (transcriptie, binding en amplificatie) werd de eiwitconcentratie drieledig verlaagd (stap 4,1). Dit werd gedaan om achtereenvolgens elimineren lage affiniteit RNA soorten. - Plaats de buisjes met de bindende reacties ongeveer 30 minuten bij 25 °C in een temperatuur blok (of op ijs).
- Fractioneren het gebonden RNA van het ongebonden RNA voor de eerste 4 ronden selectie-amplificatie met behulp van de volgende stappen.
- Filtreer het monster (100 μL) bij kamertemperatuur via een nitrocellulose filter dat aan een vacuüm spruitstuk is bevestigd.
Opmerking: het RNA-eiwit complex, maar niet het ongebonden RNA, blijft op het filter staan. - Hak het filter met ingehouden RNA in fragmenten met een steriel scheermesje; plaats deze in een centrifugebuis. Herstel RNA door de buis zachtjes te tuimelen gedurende minimaal 3 uur (of 's nachts) met filter stukken ondergedompeld in de proteïnase K (PK) buffer.
- Deproteiniseer het RNA-monster door het te vortexeren in de aanwezigheid van een gelijk volume fenol-chloroform (1:1) en vervolgens van chloroform. Herstel de waterige fase elke keer door het monster bij hoge snelheid gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te centrifugeren.
- Meng het met Natriumacetaat (0,1 volume van 3,0 M, pH 5,2) en ethanol (2 – 3 volumes van absolute ethanol, 200 proof). Laat de buis 30 minuten in een vriezer van a-80 °C, centrifugeer deze op hoge snelheid gedurende 10 minuten, en na de was-en droog stappen (stap 3,8), solubiliseer het RNA in water behandeld met DEPC. Deze stappen worden hierboven beschreven (stappen 3,6 tot en met 3,9).
- Filtreer het monster (100 μL) bij kamertemperatuur via een nitrocellulose filter dat aan een vacuüm spruitstuk is bevestigd.
- Scheid de proteïne-gebonden RNA-fracties van de ongebonden fracties voor de laatste 2 rondes (rondes 5 en 6; transcriptie, binding en amplificatie) als volgt. Verminder de eiwitconcentratie in de bindings reactie (stap 4,1) door verder driemaal te selecteren voor extra selectiedruk om hoge-affiniteits bindings sequenties te verrijken en bij voorkeur lage-affiniteits sequenties te verwijderen.
- Vooraf gegoten een inheemse polyacrylamidegel (5% met 60:1 acrylamide: bis-acrylamide ratio) in 0,5 x TBE buffer (tris-borate-EDTA) voorafgaand aan het instellen van de bovenstaande RNA: eiwit bindende (stap 4,1) reactie. Elektroforese deze gel in een koude kamer (4 °C) door toepassing van 250 V gedurende 15 min.
- Pipetteer de bovenstaande RNA: eiwitbinding Reacties (stap 4,1) in verschillende putjes van deze gel.
Opmerking: het eiwit wordt opgeslagen bij-80 °c en verdund vóór gebruik in 20 mm 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonzuur (Hepes), pH 8,0, 20% glycerol, 0,2 mm ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,05% NP-40 en 1 mm dithiotreïtol (DTT). Toevoeging van 0,5 – 1,0 mM proteaseremmer fenylmethaan sulfonyl-fluoride (PMSF) is facultatief. In de bindende reactie, deze buffer draagt ongeveer 6% glycerol, waardoor direct laden van monsters in de putten zonder de noodzaak om ze te mengen met een aparte gel-loading buffer. - Fractioneren het gebonden RNA van het ongebonden RNA met behulp van gel elektroforese in een koude kamer (4 °C) bij 250 V voor 1 tot 2 h. Dit proces wordt ook wel gel Mobility Shift assay genoemd.
Opmerking: de duur van de elektroforese varieert afhankelijk van de kenmerken van het RNA en het eiwit dat wordt gebruikt voor de binding. - Stel de gel bloot aan een röntgenfilm en Identificeer de locatie van het gebonden RNA met behulp van autoradiografie. Knip de gelslice met het gebonden RNA en steek het in een buisje.
- Inbroed de geplette gel in de PK buffer die gebruikt wordt voor elutie gedurende 3 uur of 's nachts.
- Herhaal de stappen 3,5 tot en met 3,9 die hierboven worden beschreven. Kort, Vortex het eluteerde RNA monster krachtig eerst met fenol-chloroform en vervolgens met chloroform.
- Meng natriumacetaat en ethanol met de waterige fase na chloroform extractie. Na incubatie in-80 °C vriezer, spin bij 4 °C gedurende 5 – 10 minuten om de RNA-pellet te verzamelen. Was de RNA-pellet met ethanol en lucht drogen door het deksel van de buis open te laten. Los het RNA op in water dat behandeld wordt met DEPC.
Opmerking: overschakelen naar de gel Mobility Shift-test voor fractionering maakt eliminatie mogelijk van ongewenste RNA-soorten die eventueel zijn verrijkt voor binding, bijvoorbeeld aan de nitrocellulose filter hier (of een matrix) die in de initiële rondes voor fractionering wordt gebruikt.
5. omgekeerde transcriptie en PCR-versterking
- Synthetiseer cDNA van het opgeloste RNA met behulp van reverse transcriptase en de omgekeerde primer door de 20 μL-reactie (2 μL van 10x RT-buffer, 2 μL AMV reverse transcriptase, 1 μM omgekeerde primer, 10 μL RNA, RNase-remmer optioneel) bij 42 °C gedurende 60 min te bebroed.
- Versterk de cDNA met 20 – 25 PCR-cycli zoals beschreven in stap 2,1.
6. transcriptie en eiwitbinding
- Herhaal het proces van RNA-synthese, eiwitbinding, scheiding van eiwit gebonden en ongebonden Fractie, zoals beschreven in sectie 3 – 5 hierboven.
7. analyse van RNA-eiwit interacties
- Gebruik de gel Mobility Shift assay (stap 4,4) of de filter bindings test (stap 4,3) om de bindingsaffiniteit en specificiteit te bepalen voor geselecteerde Pools of individuele sequenties binnen elke pool (zie stap 8,3).
- Gebruik autoradiografie of een fosfor Imager om banden in de afhankelijke breuk en de ongebonden fractie te detecteren en te kwantificeren.
8. klonen en sequentiëren
- Verwerk het uiteindelijke PCR-DNA-product met beperkings enzymen Bcl1 en HindIII voor 1 – 2 h, ligaat met de naar behoren verteerde pGEM3 of andere plasmiden die de beperkings plaatsen vervoeren van 2 uur tot 's nachts, Transformeer het ligatie product in bekwame bacteriële cellen door hitteschok of elektroporation met behulp van standaard moleculaire biologie procedures13.
- Kweek bacteriën 's nachts door de getransformeerde cellen op agarplaten met Luria-Bertani (LB) medium en ampicillaire (50 μg/mL) bij 37 °C te bekleden. Kies kolonies om kweek buizen met LB vloeibaar medium met ampicilineen te kweken en te groeien bij 37 °C in een schud incubator 's nachts. Reinig plasmide Dna's met DNA-inserts met behulp van een standaard plasmide isolatie protocol13.
Opmerking: commerciële kits zijn beschikbaar voor plasmide zuivering. - Sequentie van de plasmiden met DNA-inserts met behulp van de dideoxy keten beëindiging sequencing protocol, volg de instructies van de fabrikant voor sequencing14.
Opmerking: Sequentiëren kan in eigen huis worden uitgevoerd of commercieel worden uitgevoerd.
9. sequentie uitlijning
- Uitlijnen van sequenties en verkrijgen van een consensus binding site (s) met behulp van beschikbare online uitlijning tools
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De volgende opmerkingen tonen succesvolle selectie-amplificatie (SELEX). Eerst analyseerden we pool 0 en de geselecteerde sequenties voor binding aan het eiwit dat wordt gebruikt voor de iteratieve selectie-amplificatie benadering. Figuur 2 toont aan dat het zoogdier polypyrimidine-tractus bindende proteïne (PTB) nauwelijks detecteerbare binding aan de pool 0-sequentie vertoont, maar een hoge affiniteit voor de geselecteerde sequentie groep. Er was nauwelijks detecteerbare binding aan pool 0 toen we gebruikten over 300-fold hogere eiwitconcentratie voor binding dan gebruikt voor de geselecteerde pool. Zo was er ten minste een paar honderd-voudige verschil in eiwit bindende verwantschappen tussen de willekeurige of start pool en de geselecteerde pool. Deze observatie bevestigt experimenteel dat het hier beschreven selectie-amplificatie protocol succesvol is.
Ten tweede hebben we de geselecteerde pool gesequentieerd en een site voor consensus binding vastgesteld. De consensussequentie die werd verkregen door de uitlijning van de meerderheid van de geselecteerde sequenties uit de PTB-geselecteerde groep van zoogdieren was: GCCUG (Y/G) UGCYYYYCYYYG (Y/G) CCC. Dit toont aan dat we unieke pyrimidine-rijke sequenties hebben geselecteerd die PTB11binden. Toen we iteratieve selectie-amplificatie voor het RNA-bindende domein van het Drosophila PTB uitvoerden, VERRIJDERDEN we cu-rijke sequenties onderbroken door guanosines. Onder de hoge affiniteit sequenties die de Drosophila PTB geselecteerd was een 84% pyrimidine-rijke SEQUENTIE: GCUUUCCUCUGUCGCCCUUCUUCGUCCCCUG. In feite is deze sequentie vergelijkbaar met de pyrimidine-rijke sequentie aanwezig in de alpha-tropomyosine intron die bindt met hoge affiniteit aan en wordt gereguleerd door de zoogdieren PTB15. We hebben deze aanpak herhaaldelijk gebruikt om RNA-bindende eigenschappen en functies splicing regulators en een splicing factor11,15,16te bestuderen. Tabel 1 toont succesvolle voorbeelden van RNA-bindende eiwitten waarvoor Selex werd gebruikt om hun voorkeur of consensus binding site (s) te identificeren.
Ten derde toont een in vitro splicings test, die is gebaseerd op alternatieve 3 ' splice site Choice, functionele relevantie van verschillende maar overlappende RNA-bindende specifieke kenmerken van polypyrimidine-tractus bindende eiwitten. Terwijl een upstream 3 ' splice-site standaard wordt gebruikt, leidt toevoeging van de recombinant PTB tot de activering van de alternatieve of downstream 3 ' splice-site (Figuur 3). Daarentegen, toevoeging van recombinant hnRNP C17 leidt tot onderdrukking van beide 3 ' splice sites. Toevoeging van de recombinante algemene splicing factor U2AF65 keert de hnRNP C1-gemedieerde 3 ' splice site onderdrukking (Figuur 3), evenals de PTB-gemedieerde effect op downstream 3 ' splice site activering (gegevens niet weergegeven). Een eenvoudige verklaring voor deze effecten is een directe concurrentie tussen de binding van de algemene Splice factor U2AF65 en PTB (ook wel hnrnp I), die bij voorkeur bindt aan en onderdrukt bepaalde 3 ' splitst sites, of tussen U2AF65 en hnRNP C, die bindt en onderdrukt beide 3 ' splice sites.
Figuur 1: samenvatting van de belangrijkste stappen in iteratief selectie-amplificatie proces (SELEX). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: verrijking van de PTB-bindende Rna's. Toenemende concentratie (gevulde driehoeken) van recombinant PTB werd gebruikt met ofwel van pool 0 RNA of de geselecteerde pool verkregen na zes selectie rondes en amplificatie. Posities van ongebonden RNA en het RNA: proteïne complex zijn geïndiceerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Splice site switching assay valideert verschillende bindende specifieke kenmerken van pyrimidine-bindende eiwitten. (A-top) Schematische voorstelling van het splicing substraat. De splicing substraat bevat een 5 ' splice site en twee alternatieve 3 ' splice sites flaneren de Intron. Rechthoeken (open, met horizontale lijnen en effen) zijn exonen en de lijn is een intron. (A-bottom) hnRNP C1 onderdrukt de upstream 3 ' splice site (zonder activering van de downstream 3 ' splice site), terwijl PTB leidt tot activering van de downstream 3 ' splice site. Het splicing substraat werd geïnfiltreerd in een HeLa Cell nucleair extract. De splicing producten (getoond aan de zijkanten) werden geanalyseerd met behulp van een primer extension assay18 met Splice-Junction primers (pijlen), die splicing van de gemeenschappelijke 5 ' splice site herkennen aan de upstream of de downstream 3 ' splice site. (B) Recombinant U2AF65 (rU2AF65) keert het repressieve effect van hnrnp C1 om. Toevoeging van de recombinant hnRNP C1, PTB, of rU2AF65 eiwitten aan de splicing reactie wordt aangegeven door de + symbolen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Eiwit | Gewenste volgorde (en) |
| U2AF65 | U-rijk met CS |
| Sxl | U-rijk met 2-4 GS |
| Ptb | UCUUC-rijk met enkele GS |
| hnRNP C1 | U-Rijk (5-6 lang) |
| CstF64 | GU-Rich |
| hnRNP E1/E2 en K | C-Rich |
| U2AF65/U2af35 heterodimer | UUUYYYYUNUAGGU |
Tabel 1: voorkeur bindende plaatsen voor sommige RNA-bindende eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nucleïnezuur-bindende eiwitten zijn belangrijke regulatoren voor de ontwikkeling van dieren en planten. Een belangrijke eis voor de SELEX-procedure is de ontwikkeling van een test die kan worden gebruikt om eiwit afhankelijke en ongebonden RNA-fracties te scheiden. In principe kan deze test een in vitro bindende assay zijn, zoals de filter bindings test, de gel Mobility Shift assay of een matrix binding assay19 voor recombinant-eiwitten, gezuiverde eiwitten of eiwitcomplexen. De test kan ook een enzymatische assay zijn waarbij de precursoren en producten (of Intermediates) kunnen worden gescheiden op basis van grootte of een ander middel20.
Hoewel mutagenese op grote schaal is gebruikt om bindingsplaatsen voor eiwitten te karakteriseren, is het bewerkelijk, en tijdrovend en langere sequenties zijn niet zo gemakkelijk vatbaar voor verzadiging van mutagenese. De betekenis van de iteratieve binding en amplificatie benadering hier beschreven is dat niet alleen het overwinnen van enkele van de bovenstaande beperkingen, het kan het belangrijkst identificeren eerder onbekende binding sites en bieden belangrijke informatie over nucleotide-vereisten op elke positie tegelijk.
Een belangrijke overweging voor het succes van iteratieve selectie-amplificatie is bindende affiniteit en specificiteit. Doorgaans worden 12 tot 15 rondes selectie-amplificatie gebruikt en een sequentie ruimte van 1012 tot 1015 moleculen kan routinematig worden bemonsterd. De voortgang en het uiteindelijke succes van het selectie versterkings protocol kunnen worden bewaakt met behulp van een bindende assay of directe sequencing, die affiniteit voor of verrijking van specifieke sequenties in tussenliggende Pools bewaakt. Terwijl de bindende assay traditioneel werd gebruikt, maakt de komst van de volgende generatie sequencing analyse van sequentie verrijking op een manier die niet mogelijk is door handmatige Sanger-sequencing14.
Een belangrijke stap in het succes van SELEX is de vouw verrijking van de gewenste moleculen bij elke stap. Het aantal cycli dat nodig is voor SELEX varieert en is afhankelijk van verschillende factoren. Als vouwen-verrijking van gewenste of specifieke sequenties in elke ronde hoger is, zullen er minder rondes voldoende zijn. Als een assay echter een groot deel van de ongewenste sequenties in de gebonden pool toelaat, zullen extra rondes nodig zijn om de gewenste RNA-sequenties te verrijken. Een beperking van de techniek of een onbedoelde consequentie van de noodzaak van aanvullende cycli van selectie-versterking die in gedachten moet worden gehouden is de mogelijkheid dat het artefacten kan introduceren of sequenties die niet-verwante eigenschappen hebben, zoals hun vermogen om te versterken. Ten slotte, terwijl sommige toepassingen profiteren van de hoogste affiniteit bindmiddelen, voor andere toepassingen, moet een evenwicht worden gevonden tijdens het selectie-versterkings proces tussen binding affiniteit en functie, omdat strakste bindings sequenties mogelijk niet noodzakelijkerwijs de meest functionele sequenties in biologische contexten (bijvoorbeeld als een sequentie meerdere malen wordt herkend door verschillende eiwitten tijdens het splitsen).
Onder de wijzigingen en het oplossen van problemen om de procedure te verbeteren, negatieve selectie of teller selectie kan worden gebruikt om de specificiteit te verhogen. Evenzo kan het gebruik van verschillende partitioneringsprotocollen, zoals de filter bindings test gevolgd door de gel Mobility Shift Assay, de verrijking van ongewenste sequenties elimineren die bijvoorbeeld binden aan het nitrocellulose filter of een kolom matrix21. Gezien het feit dat eiwitten-nucleïnezuur interacties hebben zowel specifieke en niet-specifieke componenten, buffer voorwaarden zoals zout en pH hebben effecten op RNA-eiwit interacties. Bovendien kan het gebruik van geschikte eiwitconcentratie een direct effect hebben op het behoud van sterke, zwakke en niet-specifieke bindmiddelen. De selectiedruk kan in opeenvolgende rondes worden verhoogd, bijvoorbeeld door een concurrent RNA op te maken, de eiwitconcentratie te verminderen of de incubatietijd te verkorten. Daarom kunnen zorgvuldige overwegingen en het optimaliseren van deze parameters invloed hebben op de uitkomst van het SELEX-protocol.
Onlangs zijn er vele variaties of wijzigingen van het oorspronkelijke SELEX-protocol ontwikkeld die enkele van de bovengenoemde beperkingen overwinnen. Deze omvatten hoge doorvoer-SELEX (HT-SELEX), die combineert SELEX en massaal parallelle sequentiëren6, rnacompete, waarbij incubatie met overtollige niet-willekeurige RNA, pull-down van het gebonden RNA, fluorescerende LABELING van RNA, en analyse op micro arrays5, RNA BIND-n-seq, die RNA-affiniteits analyse combineert in een kwantitatieve en hoge doorvoer mode22, en Rapid-Selex, die het proces verkort en een niet-versterkings stap23bevat.
Chemisch gemodificeerde basen werden gebruikt om het repertoire van de RNA moleculen uit te breiden voor specifieke toepassingen24. Diagnostiek, Therapeutics, evenals moleculen met katalytische activiteiten behoren tot de vele toepassingen (waaronder in de geneeskunde) van de geselecteerde moleculen25. Aptamers vullen antistofgebaseerde protocollen aan en bieden uitstekende hulpmiddelen waarvan het potentieel, bijvoorbeeld in diagnostiek, Therapeutics en andere toepassingen, volledig moet worden benut26,27,28. In de toekomst bijvoorbeeld, klinische voordelen behoren tot de talrijke gewenste toepassingen, buiten wat de eerste FDA goedgekeurde aptamer (Pegaptanib natrium) kan leveren voor de leeftijdsgebonden Macula degeneratie. De schaalbare Proteomic technologie voor eiwit metingen biedt een stap naar het begrijpen van gezondheid en ziekten24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur verklaart dat hij geen concurrerende financiële belangen heeft.
Acknowledgments
De auteur dankt de National Institutes of Health voor de financiering uit het verleden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F.
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al.
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al.
