प्रोस्टेट कैंसर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से ट्यूमर organoids की पीढ़ी
Summary
हम नेक्रोप्सी और माउस प्रोस्टेट कैंसर मॉडल के विच्छेदन के लिए एक विधि दिखाने के लिए, प्रोस्टेट ट्यूमर विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित. माउस प्रोस्टेट ट्यूमर organoids की पीढ़ी के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया है.
Abstract
जीनों को संशोधित करने के लिए समजात पुनर्संयोजन पर आधारित विधियों ने जैविक अनुसंधान को काफी आगे बढ़ाया है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) स्तनधारी विकास और रोग के अध्ययन के लिए एक कठोर तरीका है. हमारी प्रयोगशाला प्रोस्टेट कैंसर के कई GEMMs विकसित किया है (PCa) कि साइट विशेष Cre-loxP recombinase प्रणाली और एक प्रोस्टेट विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग कर एक या कई ट्यूमर suppressor जीन की अभिव्यक्ति की कमी है. इस लेख में, हम इन पीसीए GEMMs के नेक्रोप्सी के लिए हमारी विधि का वर्णन, मुख्य रूप से माउस प्रोस्टेट ट्यूमर के विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित. पिछले दशक में विकसित नए तरीकों ने उपकला व्युत्पन्न कोशिकाओं की संस्कृति को तीन आयामों में इन विट्रो में अंग प्रणालियों को मॉडल करने में सुविधा प्रदान की है। हम भी माउस पीसीए GEMMs से ट्यूमर organoids उत्पन्न करने के लिए एक 3 डी सेल संस्कृति विधि विस्तार. पूर्व नैदानिक कैंसर अनुसंधान 2 डी सेल संस्कृति और सेल लाइन व्युत्पन्न या रोगी व्युत्पन्न xenograft मॉडल का प्रभुत्व रहा है. इन तरीकों ट्यूमर microenvironment, पूर्व नैदानिक अध्ययन में इन तकनीकों का उपयोग करने की एक सीमा की कमी है. GEMMs ट्यूमरजनन और कैंसर की प्रगति को समझने के लिए अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं। ट्यूमर organoid संस्कृति एक इन विट्रो मॉडल प्रणाली है कि ट्यूमर वास्तुकला और सेल वंश विशेषताओं recapitulates है. इसके अलावा, 3 डी सेल संस्कृति तरीकों ट्यूमर सेल संस्कृतियों की तुलना के लिए सामान्य कोशिकाओं के विकास के लिए अनुमति देते हैं, शायद ही कभी संभव 2 डी सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग कर. संयोजन में, पूर्व नैदानिक अध्ययन में GEMMs और 3 डी सेल संस्कृति का उपयोग करने के लिए कैंसर जीव विज्ञान की हमारी समझ में सुधार करने की क्षमता है.
Introduction
1980 के दशक के अंत से, समजात पुनर्संयोजन द्वारा जीनों को बदलने की क्षमता ने जैविक प्रणालियों1के अध्ययन को बहुत उन्नत किया है. प्रेरक, ऊतक-, या सेल-विशिष्ट promotor सिस्टम और साइट-विशिष्ट recombinases, जैसे Cre-loxP, दोनों लौकिक और स्थानिक रूप से आनुवंशिक संशोधनों पर नियंत्रण की सुविधा के द्वारा उन्नत आनुवंशिक अध्ययन किया है2,3, 4. इन आनुवंशिक रणनीतियों के संयोजन ने प्रायोगिक मॉडल प्रणालियों5,6,7की एक विस्तृत सरणी बनाई है .
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) कैसे व्यक्तिगत जीन या जीन के समूहों स्तनधारी विकास और रोग को प्रभावित करने का आकलन करने के लिए एक अभिन्न उपकरण हैं. पूर्व नैदानिक कैंसर अनुसंधान में, GEMMs कैंसर के विकास, प्रगति, और उपचार8का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक और कठोर विधि हैं। हमारी प्रयोगशाला पैदा करने और कैंसर GEMMs की विशेषता में माहिर हैं.
संयुक्त राज्य अमेरिका में पुरुषों के बीच सबसे उच्च निदान गैर-cutaneous कैंसर प्रोस्टेट कैंसर (PCa) है. पीसीए के साथ रोगियों के बहुमत कम जोखिम रोग और जीवित रहने की उच्च संभावना है, लेकिन अस्तित्व की दर काफी गिरावट जब रोग उन्नत चरणों में निदान किया जाता है या यदि लक्षित हार्मोनल चिकित्सा आक्रामक, गैर इलाज पीसीए के लिए प्रगति लाती है उपप्रकार9,10. हमारी प्रयोगशाला GEMMs विकसित किया है कि एक या एक से अधिक ट्यूमर suppressor जीन के floxed alleles का उपयोग. पुनर्संयोजन और ट्यूमर suppressor जीन अभिव्यक्ति की हानि प्रोस्टेट में विशेष रूप से होता है क्योंकि हम केवल प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं में सक्रिय probasin प्रमोटर के क्रे रिकॉमग्नेडाउन बहाव के साथ एक transgene शुरू की है11, 12.हमने अपने जीईएम को एम टी/एमजी नामक क्रे रिपोर्टर ट्रांसजीन को भी शामिल करने के लिए पैदा किया है, जो क्रे13के साथ कोशिकाओं में क्रे और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) अभिव्यक्ति की कमी वाली कोशिकाओं में टमाटर फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है । जबकि इस विधि और हमारे प्रतिनिधि परिणाम की प्रस्तुति GEMMs हम अपनी प्रयोगशाला में अध्ययन दिखाने के लिए, इस प्रोटोकॉल किसी भी माउस मॉडल से प्रोस्टेट कैंसर organoids उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, के रूप में हमारे प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में विस्तार से चर्चा की, हमने देखा है कि कुछ ट्यूमर विशेषताओं प्रोस्टेट कैंसर organoid पीढ़ी के लिए इष्टतम हैं.
पिछले दशक में , उपकला मूल के ऊतकों से कोशिकाओं को संचित करने के नए तरीकों से इन विट्रो14,15में अंग प्रणालियों को मॉडल करने की हमारी क्षमता में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है . शब्द “3 डी सेल संस्कृति” organoids की स्थापना और बनाए रखने में शामिल तकनीकों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है, जो आम तौर पर कोशिकाओं से बना संरचनाओं के रूप में परिभाषित किया जा सकता है कि अंग-विशिष्ट कोशिका वंश द्वारा संचालित माध्यमिक वास्तुकला इकट्ठा विशेषताओं16| इन नए तरीकों में क्लासिक 2 D सेल संस्कृति से अलग हैं कि कोशिकाओं को दीर्घकालिक विकास के लिए परिवर्तन या अमरीकरण की आवश्यकता नहीं है; इस प्रकार, सामान्य कोशिकाओं के 3 डी संस्कृतियों रोगग्रस्त कोशिकाओं की तुलना में किया जा सकता है. यह कैंसर अनुसंधान में विशेष रूप से मूल्यवान है जहां सामान्य सेल नियंत्रण संस्कृतियों आम तौर पर उपलब्ध नहीं किया गया है. इसके अलावा, organoids स्वतः उचित रूप से विभेदित सेल प्रकार के साथ माध्यमिक ऊतक आर्किटेक्चर फार्म, उन्हें एक बेहतर मॉडल प्रणाली बनाने के लिए 2 डी सेल लाइनों17से इन विट्रो में कैंसर को समझने के लिए. हमारी प्रयोगशाला ट्यूमर मुद्दे से 3 डी organoid लाइनों बनाया गया है हमारे PCA GEMMs से अलग करने के लिए हमारे vivo डेटा में पूरक और प्रयोगों जो GEMMs में संभव नहीं होगा प्रदर्शन.
इस आलेख में, हम विशिष्ट माउस प्रोस्टेट लोब और मेटास्टैटिक घावों के विच्छेदन सहित, पीसीए GEMMs की पूरी नेक्रोप्सी के लिए लिखित और दृश्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम वर्णन और माउस प्रोस्टेट ट्यूमर से organoids पैदा करने के लिए एक कदम दर कदम विधि दिखाने के एक प्रोटोकॉल के आधार पर पहले Drost एट अल द्वारा प्रकाशित सामान्य माउस प्रोस्टेट उपकला ऊतक से organoids प्राप्त करने के लिए18.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोस्टेट ट्यूमर विच्छेदन और organoid पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
गैर-प्रोस्टेट ऊतक को हटाना और माउस प्रोस्टेट ट्यूमर के ठीक विच्छेदन कैंसर organoids के इष्टतम पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकस्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में केल्विन कू प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहते हैं कि एचईके293 कोशिकाओं को या तो हा-माउस नोगिन-एफसी या हा-माउस Rspo1-Fc के साथ stably transfected प्रदान करने के लिए। हम भी हमें अपनी प्रयोगशाला में फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की अनुमति के लिए डॉ डीन तांग धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम CA179907 द्वारा D.W.G. के लिए राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से समर्थित किया गया था. Roswell पार्क व्यापक कैंसर केंद्र में साझा संसाधनों स्वास्थ्य कैंसर केंद्र सहायता अनुदान CA016056 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित थे.
Materials
| 0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
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