Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi
Summary
Biz prostat tümörü diseksiyon odaklanmak, fare prostat kanseri modellerinin otopsi ve diseksiyon için bir yöntem göstermektedir. Fare prostat tümörü organoidlerin oluşturulması için adım adım bir protokol de sunulmaktadır.
Abstract
Genleri değiştirmek için Homolog rekombinasyon dayalı Yöntemler önemli ölçüde biyolojik araştırma ilerletti. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMMs) memeli gelişimi ve hastalığı okumak için titiz bir yöntemdir. Laboratuvarımız, siteye özel CRE-loxP Rekombinaz sistemi ve prostat spesifik promotör kullanılarak bir veya birden fazla tümör bastırıcı genlerin ifadesinin bulunmadığı prostat kanseri (PCa) çeşitli GEMMs geliştirdi. Bu yazıda, öncelikle fare prostat tümörlerinin diseksiyonu üzerinde duruluyor, bu PCA gemms otopsi için yöntemi açıklanmaktadır. Son on yıl içinde geliştirilen yeni yöntemler, üç boyutta organ sistemlerine model olarak epitelyal türev hücrelerin kültürünü kolaylaştırmış durumdadır. Biz de detay bir 3D hücre kültürü yöntemi fare PCa GEMMs tümör organoids oluşturmak için. Klinik öncesi kanser araştırması 2B hücre kültürü ve hücre çizgisinin türetildiği veya hasta tarafından türetilen xenograft modellerinin hakimiyetindedir. Bu yöntemler tümör mikroçevre eksikliği, klinik öncesi çalışmalarda bu teknikleri kullanarak bir sınırlama. GEMMs daha fizyolojik-tümör ve kanser ilerlemesini anlamak için ilgilidir. Tümör nevuslardır kültürü, tümör mimarisini ve hücre soy özelliklerini tekrar eden bir in vitro model sistemidir. Ayrıca, 3D hücre kültürü yöntemleri tümör hücresi kültürlerine kıyasla normal hücrelerin büyümesini sağlar, 2D hücre kültürü tekniklerini kullanarak nadiren mümkündür. Kombinasyon halinde, ön klinik çalışmalarda GEMMs ve 3D hücre kültürünün kullanımı kanser biyolojisi anlayışımızı iyileştirmek için potansiyele sahiptir.
Introduction
1980 ‘ lerin sonlarında, Homolog rekombinasyon tarafından genler değiştirmek için yeteneği büyük ölçüde biyolojik sistemlerin çalışma Gelişmiş1. İndüklenebilir, doku veya hücreye özgü promotor sistemleri ve CRE-loxp gibi siteye özgü rekombinazlar, hem geçici olarak hem de uzamsal olarak2,3, genetik modifikasyonlar üzerinde kontrol kolaylaştırarak genetik çalışmalar gelişmiş 4‘ ü yapın. Bu genetik stratejilerin kombinasyonu deneysel model sistemleri5,6,7geniş bir dizi yarattı.
Genetik olarak tasarlanan fare modelleri (GEMMs), bireysel genler veya genler gruplarının memelin gelişimini ve hastalığı nasıl etkilediğini değerlendirmek için ayrılmaz bir araçtır. Klinik öncesi kanser araştırmalarında, GEMMs kanser gelişimi, progresyon ve tedavi8‘ i incelemek için en fizyolojik olarak alakalı ve titiz bir yöntemdir. Bizim laboratuar üreten ve kanser GEMMs karakterize uzmanlaşmıştır.
Amerika Birleşik Devletleri ‘nde erkekler arasında en yüksek tanısı olmayan kutanöz kanser prostat kanseri (PCa). PCa olan hastaların çoğunluğu düşük riskli hastalık ve yüksek hayatta kalma olasılığı vardır, ancak hastalık ileri aşamalarında teşhis edildiğinde ya da hedeflenen hormonal tedavi agresif, non-tedavi edilemez PCa ilerlemesi indükler ise hayatta kalma oranları büyük ölçüde düşüş alt türler9,10. Laboratuvarımız bir veya daha fazla tümör bastırıcı genlerin floxed alleni kullanan GEMMs geliştirdi. Yeniden kombinasyon ve tümör bastırıcı gen ifade kaybı özellikle prostat oluşur çünkü biz CRE Rekombinaz aşağı aşağı probasin organizatör ile bir transgeni tanıtıldı sadece prostat epitelyal hücrelerde aktive11, 12. biz de bir CRE muhabiri transgene MT/mg denilen içeren bizim gemms yetiştirilen var, CRE ve yeşil floresan protein (Gfp) hücre içinde c-13Ile hücrelerde eksik hücrelerde domates floresan protein ifadesi indükler. Bu yöntemin sunumu ve temsilcimiz, laboratuvarımızda çalışmamızda GEMMs ‘i gösterirken, bu protokol herhangi bir fare modelinden prostat kanseri organoidleri oluşturmak için kullanılabilir. Ancak, temsili sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak tartışıldığı gibi, bazı tümör özelliklerinin prostat kanseri nevuslardır üretimi için optimum olduğunu gözlemledik.
Son on yıl içinde, epitelyal orijinli dokulardan oluşan yeni kültür hücreleri yöntemleri, org sistemleri içinde vitro14,15modellik yeteneğimizde önemli gelişmelere yol açmıştır. “3D hücre kültürü” terimi, organoidlerin kurulması ve sürdürülmesinde yer alan tekniklere atfedilmiştir, bu da genellikle Organ-spesifik hücre sırlarıyla tahrik edilen ikincil mimarisi birleştiren hücrelerden oluşan yapılar olarak tanımlanabilir. özellikleri16. Bu yeni yöntemler, hücrelerin uzun vadeli büyüme için dönüşüm veya ölümsüzleştirme gerektirmeyen klasik 2D hücre kültüründen farklıdır; Böylece, normal hücrelerin 3D kültürler hastalıklı hücrelere kıyasla olabilir. Bu özellikle normal hücre kontrol kültürlerinin genellikle mevcut olmadığı kanser araştırmalarında değerlidir. Buna ek olarak, organoids kendiliğinden uygun farklılaşan hücre türleri ile ikincil doku mimarileri oluşturmak, onları daha iyi bir model sistemi 2D hücre hatları17daha kanser anlamak için yapmak. Laboratuvarımız bizim PCA gemms izole tümör sorunu 3D nevuslardır hatları yarattı bizim in vivo veri tamamlamak ve gemms mümkün olmayacaktır deneyler gerçekleştirmek için.
Bu yazıda, farklı fare prostat lobları ve metastatik lezyonların diseksiyonu da dahil olmak üzere PCA gemms tam otopsi için yazılı ve görsel protokoller sunuyoruz. Daha önce Drost ve Al tarafından yayınlanan bir protokol temelinde fare prostat tümörlerinden organoidler oluşturmak için adım adım bir yöntem tarif ve gösteriyoruz. normal fare prostat epitelyal dokusundan organoidler türetmek için18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prostat tümörü diseksiyonu ve nevuslardır üretimi için protokol içinde kritik adımlar
Prostat dışı doku ve fare prostat tümörünün ince diseksiyonu kaldırılması hem prostat olmayan epitelyal hücreler ve normal prostat epitelyal hücreler organoidler oluşturacaktır beri kanser organoidlerin optimum nesil için çok önemlidir. Katı prostat tümörlerinde özellikle, uygun hücrelerin sayısını azaltacak nekrotik doku ile kontaminasyon kaldırmak için uygun tümör alanlarını i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Stanford Üniversitesi ‘ndeki Calvin Kuo Laboratuvarı ‘na, HA-Mouse noggin-FC ya da HA-Mouse Rspo1-FC ile HEK293 hücrelerin stabil bir şekilde transfükresini sağlamak için teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Dr. Dean Tang ‘a laboratuvarında floresan Diseksiyon mikroskobu erişmemize izin verdiği için teşekkür etmek istiyoruz. Bu iş Ulusal Kanser Enstitüsü CA179907 tarafından D.W.G. tarafından destekleniyordu. Roswell Park kapsamlı Kanser Merkezi ‘nde paylaşılan kaynaklar sağlık kanser merkezi destek Grant CA016056 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
