Поколение опухолевых органоидов из генетически модифицированных моделей мыши рака простаты
Summary
Мы показываем метод для некропсии и вскрытия моделей рака простаты мыши, фокусируя на рассечении опухоли простаты. Также представлен пошаговой протокол для генерации органов опухоли предстательной железы мыши.
Abstract
Методы, основанные на гомологионной рекомбинации для изменения генов, значительно способствовали биологическим исследованиям. Генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) являются строгим методом для изучения развития млекопитающих и болезней. Наша лаборатория разработала несколько GEMMs рака предстательной железы (PCa), которые не имеют выражения одного или нескольких генов супрессора опухоли с помощью сайта конкретных Cre-loxP рекомбиназы системы и простаты конкретных промоутер. В этой статье мы описываем наш метод некропсии этих PCa GEMMs, в первую очередь упором на вскрытие опухолей простаты мыши. Новые методы, разработанные за последнее десятилетие, облегчили культуру клеток, полученных из эпителии, для моделирования систем органов в пробирке в трех измерениях. Мы также подробно 3D-метод культуры клеток для генерации опухолевых органоидов из мыши PCa GEMMs. Доклинические исследования рака были доминируют 2D-клеточной культуры и клеточной линии полученных или пациента полученных ксенотрансплантата моделей. Эти методы не хватает микроокружения опухоли, ограничение использования этих методов в доклинических исследованиях. ГЕМмы более физиологически значимы для понимания опухолевого и рака прогрессии. Опухолевая органоидная культура представляет собой систему модели in vitro, которая резюмирует архитектуру опухоли и характеристики клеточной линии. Кроме того, методы 3D-культуры клеток позволяют расти нормальных клеток для сравнения с культурами опухолевых клеток, редко возможно, используя методы 2D-клеточной культуры. В сочетании, использование GEMMs и 3D-клеточной культуры в доклинических исследованиях имеет потенциал для улучшения нашего понимания биологии рака.
Introduction
С конца 1980-х годов способность изменять гены с помощью гомологичных рекомбинаций значительно продвинула изучение биологических систем1. Индуцированные, ткани- или клеточные промоторные системы и конкретные рекомбиназы, такие как Cre-loxP, продвинули генетические исследования, облегчая контроль над генетическими модификациями как в и временно, так и пространственно2,3, 4. Сочетание этих генетических стратегий создало широкийспектр экспериментальных модельных систем 5,6,7.
Генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) являются неотъемлемым инструментом для оценки того, как отдельные гены или группы генов влияют на развитие млекопитающих и болезни. В доклинических исследований рака, GEMMs являются наиболее физиологически релевантных и строгий метод для изучения развития рака, прогрессирование, и лечение8. Наша лаборатория специализируется на генерации и характеристике гЕММ рака.
Наиболее диагностируется некочее рак среди мужчин в Соединенных Штатах является рак простаты (PCa). Большинство пациентов с PCa имеют низкий риск заболевания и высокую вероятность выживания, но выживаемость резко снижается, когда болезнь диагностируется на поздних стадиях или если целевая гормональная терапия вызывает прогрессирование к агрессивной, неизлечимой PCa подтипы9,10. Наша лаборатория разработала GEMMs, которые используют флоксированные аллели одного или нескольких генов супрессоров опухолей. Рекомбинация и потеря экспрессии гена супрессора опухоли происходит именно в предстательной железе, потому что мы ввели трансген с рекомбиназой Cre вниз по течению пробосин промотор активирован только в эпителиальных клетках простаты11, 12. Мы также разводили наши GEMMs содержать Cre репортер трансген называется mT/mG, который вызывает томатфлуалистое выражение белка в клетках, не хватает Cre и зеленый флуоресцентный белок (GFP) выражение в клетках с Cre13. В то время как презентация этого метода и наши репрезентативные результаты показывают, что GEMMs, которые мы изучаем в нашей лаборатории, этот протокол может быть использован для генерации органов рака простаты из любой модели мыши. Однако, как подробно обсуждается в нашем разделе репрезентативных результатов, мы заметили, что определенные характеристики опухоли являются оптимальными для генерации органов орака простаты.
В последнее десятилетие, новые методы культивирования клеток из тканей эпителиального происхождения привело к значительным достижениям в нашей способности моделировать системы органов в пробирке14,15. Термин “культура 3D клеток” был отнесен к методам, участвующим в создании и поддержании органоидов, которые могут быть определены как структуры, состоящие из клеток, которые собирают вторичную архитектуру, движимую органно-специфической линией клеток характеристики16. Эти новые методы отличаются от классической 2D-клеточной культуры в том, что клетки не требуют трансформации или увековечения для долгосрочного роста; таким образом, 3D культуры нормальных клеток можно сравнить с больными клетками. Это особенно ценно в исследованиях рака, где нормальные культуры контроля клеток, как правило, не были доступны. Кроме того, органоиды спонтанно образуют вторичные архитектуры тканей с соответствующим дифференцированным типом клеток, что делает их лучшей модельной системой для понимания рака в пробирке, чем 2D-клеточные линии17. Наша лаборатория создала 3D органоидные линии из опухолевого вопроса, изолированных от наших PCa GEMM, чтобы дополнить наши данные in vivo и проводить эксперименты, которые не были бы осуществимы в GEMMs.
В этой статье мы представляем письменные и визуальные протоколы для полной некропсии PCa GEMMs, включая вскрытие различных долей простаты мыши и метастатических поражений. Мы описываем и показываем пошаговой метод генерации органоидов из опухолей простаты мыши на основе протокола, ранее опубликованного Drost et al. для получения органоидов из нормальной эпителиальной ткани простаты мыши18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в рамках протокола для вскрытия опухоли предстательной железы и органоидного поколения
Удаление непростастовой ткани и тонкое вскрытие опухоли простаты мыши имеет решающее значение для оптимального поколения раковых органоидов, так как как непростаэпиля…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить лабораторию Calvin Kuo в Стэнфордском университете за предоставление клеток HEK293, стабонетых либо HA-мышьNoggin-Fc или HA-mouse Rspo1-Fc. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Дина Тан за предоставленную нам доступ к флуоресцентным рассеиванием микроскопа в его лаборатории. Эта работа была поддержана CA179907 d.W.G. от Национального института рака. Общие ресурсы в Розуэлл Парк Всеобъемлющий онкологический центр были поддержаны Национальными институтами здравоохранения онкологический центр поддержки Грант CA016056.
Materials
| 0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
