Generazione di organidi tumorali da modelli murini geneticamente ingegnerizzati del cancro alla prostata
Summary
Mostriamo un metodo per la necropsia e la dissezione dei modelli di cancro alla prostata del topo, concentrandosi sulla dissezione del tumore alla prostata. Viene inoltre presentato un protocollo passo-passo per la generazione di organoidi tumorali della prostata del topo.
Abstract
I metodi basati sulla ricombinazione omologa per modificare i geni hanno notevolmente favorito la ricerca biologica. I modelli murini geneticamente ingegnerizzati (GEMM) sono un metodo rigoroso per studiare lo sviluppo e la malattia dei mammiferi. Il nostro laboratorio ha sviluppato diverse GEMM di cancro alla prostata (PCa) che non sono espressione di uno o più geni soppressori tumorali utilizzando il sistema ricombinase Cre-loxP site-specific e un promotore specifico della prostata. In questo articolo, descriviamo il nostro metodo per la necropsia di questi GEMM PCa, concentrandoci principalmente sulla dissezione dei tumori della prostata del topo. Nuovi metodi sviluppati nell’ultimo decennio hanno facilitato la coltura delle cellule derivate epiteliali per modellare i sistemi di organi in vitro in tre dimensioni. Inoltre, dettagliamo un metodo di coltura cellulare 3D per generare organoidi tumorali dai GEMM PCa del topo. La ricerca pre-clinica sul cancro è stata dominata dalla coltura cellulare 2D e dai modelli di xenotrapianto derivati dalla linea cellulare o derivati dal paziente. Questi metodi mancano di microambiente tumorale, una limitazione dell’utilizzo di queste tecniche negli studi pre-clinici. Le GEMM sono più rilevanti dal livello fisiologico per comprendere la tumorigenesi e la progressione del cancro. La coltura organoide tumorale è un sistema di modelli in vitro che riassume l’architettura del tumore e le caratteristiche di lignaggio cellulare. Inoltre, i metodi di coltura cellulare 3D consentono la crescita di cellule normali per il confronto con le colture cellulari tumorali, raramente possibile utilizzando tecniche di coltura cellulare 2D. In combinazione, l’uso delle GEMM e della coltura cellulare 3D negli studi preclinici ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione della biologia del cancro.
Introduction
Dalla fine degli anni ’80, la capacità di alterare i geni con la ricombinazione omologa ha notevolmente avanzato lo studio dei sistemi biologici1. Sistemi promotori inducibili, tissutali o specifici delle cellule e ricombinazioni site-specific, come Cre-loxP, ha avanzato studi genetici facilitando il controllo sulle modifiche genetiche sia dal punto di vista temporale che spaziale2,3, 4. La combinazione di queste strategie genetiche ha creato una vasta gamma di sistemi di modelli sperimentali5,6,7.
I modelli murini geneticamente progettati (GEMM) sono uno strumento integrale per valutare in che modo i singoli geni o gruppi di geni influenzano lo sviluppo e la malattia dei mammiferi. Nella ricerca pre-clinica sul cancro, le GEMM sono il metodo più fisiologicamente rilevante e rigoroso per studiare lo sviluppo, la progressione e il trattamento del cancro8. Il nostro laboratorio è specializzato nella generazione e nella caratterizzazione delle GEMM tumorali.
Il cancro non cutaneo più altamente diagnosticato tra gli uomini negli Stati Uniti è il cancro alla prostata (PCa). La maggior parte dei pazienti con PCa ha una malattia a basso rischio e un’elevata probabilità di sopravvivenza, ma i tassi di sopravvivenza diminuiscono drasticamente quando la malattia viene diagnosticata in stadi avanzati o se la terapia ormonale mirata induce la progressione a PCa aggressiva e non curabile sottotipi9,10. Il nostro laboratorio ha sviluppato GEMM che utilizzano alleli sxed di uno o più geni soppressori tumorali. La ricombinazione e la perdita dell’espressione genica del soppressore tumorale si verifica specificamente nella prostata perché abbiamo introdotto un transgene con Cre ricombinase a valle del promotore probasinattivato attivato solo nelle cellule epiteliali prostata11, 12.Abbiamo anche allevato le nostre GEMM per contenere un Transgene Cre reporter chiamato mT/mG, che induce l’espressione delle proteine fluorescenti di pomodoro in cellule prive di Cre e proteina fluorescente verde (GFP) espressione nelle cellule con Cre13. Mentre la presentazione di questo metodo e i nostri risultati rappresentativi mostrano gemm che studiamo nel nostro laboratorio, questo protocollo può essere utilizzato per generare organoidi di cancro alla prostata da qualsiasi modello murino. Tuttavia, come discusso in dettaglio nella nostra sezione dei risultati rappresentativi, abbiamo osservato che alcune caratteristiche del tumore sono ottimali per la generazione di organoidi per il cancro alla prostata.
Nell’ultimo decennio, nuovi metodi di coltura delle cellule dai tessuti di origine epiteliale hanno portato a progressi significativi nella nostra capacità di modellare i sistemi di organi in vitro14,15. Il termine “coltura cellulare 3D” è stato attribuito alle tecniche coinvolte nella definizione e manutenzione degli organoidi, che possono essere generalmente definite come strutture costituite da cellule che assemblano l’architettura secondaria guidata dal lignaggio cellulare specifico dell’organo caratteristiche16. Questi nuovi metodi sono distinti dalla cultura cellulare 2D classica in quanto le celle non richiedono trasformazione o immortalizzazione per la crescita a lungo termine; pertanto, le colture 3D delle cellule normali possono essere confrontate con le cellule malate. Ciò è particolarmente utile nella ricerca sul cancro, dove le normali colture di controllo cellulare non sono state in genere disponibili. Inoltre, gli organoidi formano spontaneamente architetture di tessuti secondari con tipi di cellule opportunamente differenziate, rendendoli un sistema modello migliore per comprendere il cancro in vitro rispetto alle linee cellulari 2D17. Il nostro laboratorio ha creato linee organoidi 3D da un problema tumorale isolato dai nostri GEMM PCa per integrare i nostri dati in vivo ed eseguire esperimenti che non sarebbero fattibili nei GEMM.
In questo articolo, presentiamo protocolli scritti e visivi per la necropsia completa delle PCa GEMMs, tra cui la dissezione di lobi della prostata del topo distinti e lesioni metastatiche. Descriviamo e mostriamo un metodo passo-passo per generare organoidi da tumori della prostata del topo sulla base di un protocollo precedentemente pubblicato da Drost et al. per la derivazione di organoidi dal normale tessuto epiteliale della prostata del topo18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passi critici all’interno del protocollo per la dissezione del tumore alla prostata e la generazione di organoidi
La rimozione del tessuto non prostatico e la dissezione fine del tumore alla prostata del topo è cruciale per la generazione ottimale di organoidi tumorali poiché sia le cellule epiteliali non prostata che le normali cellule epiteliali della prostata genereranno organoidi. Per i tumori della prostata solida in particolare, è fondamentale isolare aree di tumore vitale per rimuovere la co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Calvin Kuo Laboratory della Stanford University per aver fornito alle cellule HEK293 catetreganti trascate sia il topo HA Noggin-Fc che l’HA-mouse Rspo1-Fc. Vorremmo anche ringraziare il dottor Dean Tang per averci permesso di accedere al microscopio di dissezione fluorescente nel suo laboratorio. Questo lavoro è stato supportato da CA179907 a D.W.G. dal National Cancer Institute. Le risorse condivise del Roswell Park Comprehensive Cancer Center sono state supportate dal National Institutes of Health Cancer Center Support Grant CA016056.
Materials
| 0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
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