전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성
Summary
우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.
Abstract
유전자를 수정하기 위해 상동 재조합에 기초한 방법은 생물학적 연구를 상당히 발전시켰습니다. 유전자 조작 마우스 모델 (GEMM)은 포유류 발달과 질병을 연구하기위한 엄격한 방법입니다. 우리의 실험실은 사이트 특이적인 Cre-loxP 재조합 시스템 및 전립선 특이적 프로모터를 사용하여 하나 또는 다중 종양 억제유전자의 발현이 결여된 전립선암(PCa)의 여러 GEMM을 개발하였다. 이 문서에서는, 우리는 주로 마우스 전립선 종양의 해부에 초점을 맞추고, 이러한 PCa GEMMs의 부검을위한 우리의 방법을 설명합니다. 지난 10년 동안 개발된 새로운 방법은 생체외에서 기관 시스템을 3차원으로 모델링하기 위해 상피 유래 세포의 배양을 촉진하였다. 우리는 또한 마우스 PCa GEMMs에서 종양 오르가노이드를 생성하는 3D 세포 배양 방법을 자세히 설명합니다. 전임상 암 연구는 2D 세포 배양 및 세포주 유래 또는 환자 유래 이종이식 모델에 의해 지배되고 있다. 이러한 방법은 종양 미세 환경이 부족하며, 전임상 연구에서 이러한 기술을 사용하는 데 제한이 있다. GEMM은 종양 발생 및 암 진행을 이해하는 데 더 생리학적으로 관련이 있습니다. 종양 오르가노이드 배양은 종양 건축 및 세포 계통 특성을 재량화하는 체외 모델 시스템입니다. 또한, 3D 세포 배양 방법은 종양 세포 배양에 비해 정상 세포의 성장을 허용하며, 2D 세포 배양 기술을 사용하는 경우는 거의 불가능합니다. 결합에서, 전 임상 연구에서 GEMM 및 3D 세포 배양을 사용하는 것은 암 생물학의 우리의 이해를 향상시킬 가능성이 있습니다.
Introduction
1980 년대 후반 이후, 상동 재조합에 의해 유전자를 변경하는 능력은크게 생물학적 시스템의 연구를 진행했다 1. 유도성, 조직 또는 세포 특이적 운동 시스템 및 Cre-loxP와 같은 부위 별 재조합제는 현적으로 및 공간적으로모두유전 적 변형에 대한 제어를 용이하게하여 유전자 연구를 진행했다 2, 3 ,3, 4. 이러한 유전 전략의 조합은 실험 모델 시스템 5,6,7의 다양한 배열을 만들었습니다.
유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)는 개별 유전자 또는 유전자 그룹이 포유류 발달과 질병에 미치는 영향을 평가하는 필수적인 도구입니다. 전 임상 암 연구에서 GEMM은 암 발병, 진행 및 치료를 연구하는 가장 생리학적으로 관련성이 있고 엄격한 방법입니다8. 우리의 실험실은 암 GEM을 생성하고 특성화하는 것을 전문으로합니다.
미국에 있는 남자 중 가장 높게 진단된 비 절단암은 전립선암입니다 (PCa). PCa를 가진 환자의 대다수는 저위험 질병 및 생존의 높은 가능성을 가지고 있습니다, 그러나 질병이 향상된 단계에서 진단될 때 또는 표적으로 한 호르몬 치료가 공격적인, 비 치료가능한 PCa에 진행을 유도하는 경우에 생존율은 급격히 감소합니다 하위 유형9,10. 우리의 실험실은 하나 이상의 종양 억제 유전자의 floxed 대틀을 이용하는 GEMM를 개발했습니다. 종양 억제 유전자 발현의 재조합 및 손실은 전립선 상피 세포에서만 활성화된 프로바신 프로모터의 Cre 재조합 하류를 가진 이식유전자를 도입했기 때문에 전립선에서 구체적으로 발생한다(11). 12. 우리는 또한 Cre 13을 가진 세포에서 Cre 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현이 결여된 세포에서 토마토 형광 단백질발현을 유도하는 mT/mG라는 Cre 리포터 이식유전자를 함유하기 위해 우리의 GEMM을 사육하였다. 이 방법의 프리젠 테이션과 우리의 대표적인 결과는 우리가 우리의 실험실에서 공부하는 GEMM을 보여주지만, 이 프로토콜은 어떤 마우스 모형든지에서 전립선암 오르가노이드를 생성하는 것을 이용될 수 있습니다. 그러나, 우리의 대표적인 결과 섹션에서 상세히 논의된 바와 같이, 우리는 특정 종양 특성이 전립선암 오르가노이드 생성에 최적이라는 것을 관찰하였다.
지난 10 년 동안, 상피 기원의 조직에서 세포를 배양하는 새로운 방법은 시험관 내 기관 시스템을 모델링하는 능력의 상당한 발전을 주도했다14,15. 용어 “3D 세포 배양”은 일반적으로 장기 특이적 세포 계보에 의해 구동 되는 이차 아키텍처를 조립 하는 세포로 구성 된 구조로 정의될 수 있는 오르가노이드를 확립 하고 유지에 관련 된 기술에 기인 했다 특성16. 이러한 새로운 방법은 세포가 장기 성장을 위해 변형 또는 불멸화를 필요로 하지 않는다는 점에서 고전적인 2D 세포 배양과 구별된다; 따라서, 정상 세포의 3D 배양은 병에 걸린 세포와 비교될 수 있다. 이것은 일반적인 세포 통제 문화가 전형적으로 유효하지 않은 암 연구에서 특히 귀중합니다. 또한, 오르가노이드는 적절하게 분화된 세포 유형을 가진 이차 조직 구조를 자발적으로 형성하여 2D 세포주(17)보다 시험관내 암을 이해하는 더 나은 모델 시스템이 다. 우리의 실험실은 우리의 생체 내 데이터를 보완하고 GEMM에서 실현 가능하지 않을 실험을 수행하기 위해 우리의 PCa GEMM에서 분리 된 종양 문제에서 3D organoid 라인을 만들었습니다.
이 문서에서는, 우리는 PCa GEMMs의 완전한 necropsy를 위한 서면및 시각적 프로토콜을 제시합니다, 명백한 마우스 전립선 엽 및 전이성 병변의 해부를 포함하여. 우리는 정상 마우스 전립선 상피 조직(18)으로부터 오르가노이드를 유도하기 위해 Drost et al.에 의해 이전에 발표된 프로토콜에 기초하여 마우스전립선 종양으로부터 오르가노이드를 생성하는 단계별 방법을 설명하고 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전립선 종양 해부 및 오르가노이드 생성을 위한 프로토콜 내의 중요한 단계
비 전립선 조직의 제거 및 마우스 전립선 종양의 미세 해부는 비 전립선 상피 세포와 정상 전립선 상피 세포 모두 오르가노이드를 생성하기 때문에 암 오르가노이드의 최적 생성에 매우 중요합니다. 특히 고형 전립선 종양의 경우, 생존 가능한 세포의 수를 줄일 괴사 조직오염을 제거하기 위해 실행 가능한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 HEK293 세포가 HA 마우스 Noggin-Fc 또는 HA 마우스 Rspo1-Fc로 안정적으로 형질감염된 것을 제공한 스탠포드 대학의 캘빈 쿠오 연구소에 감사드립니다. 우리는 또한 우리가 그의 실험실에 있는 형광 해부 현미경에 접근할 수 있게 해 준 딘 탕 박사에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 국립 암 연구소에서 D.W.G.에 CA179907에 의해 지원되었다. 로스웰 파크 종합 암 센터의 공유 자원은 국립 보건원 암 센터 지원 보조금 CA016056에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
