从前列腺癌的遗传工程小鼠模型生成肿瘤有机体
Summary
介绍了一种小鼠前列腺癌模型的尸检和解剖方法,重点是前列腺肿瘤解剖。提出了小鼠前列腺肿瘤器官生成分步方案。
Abstract
基于同源重组来修饰基因的方法大大推进了生物学研究。基因工程小鼠模型(GEMM)是研究哺乳动物发育和疾病的严格方法。我们的实验室已经开发出几个前列腺癌(PCa)的GEMM,这些GemM缺乏使用位点特异性Cre-loxP重组酶系统和前列腺特异性促进剂表达的一个或多个肿瘤抑制基因。在本文中,我们将介绍我们这些PCa GEMM的尸检方法,主要侧重于小鼠前列腺肿瘤的解剖。过去十年开发的新方法促进了上皮衍生细胞的培养,以三维在体外模拟器官系统。我们还详细介绍了一种3D细胞培养方法,用于从小鼠PCa GEMM生成肿瘤器官。临床前癌症研究一直以二维细胞培养和细胞系衍生或患者衍生异种移植模型为主。这些方法缺乏肿瘤微环境,这是临床前使用这些技术的限制。GEMM 在生理上更相关,有助于了解肿瘤发生和癌症进展。肿瘤有机体培养是一种体外模型系统,可概括肿瘤结构及细胞系特征。此外,3D细胞培养方法允许正常细胞的生长,以便与肿瘤细胞培养进行比较,使用2D细胞培养技术很少可能。结合在临床前研究中使用 GEMM 和 3D 细胞培养,有可能提高我们对癌症生物学的理解。
Introduction
自20世纪80年代末以来,通过同源重组来改变基因的能力极大地推动了生物系统1的研究。诱导、组织或细胞特异性的推进系统和位点特异性重组酶,如Cre-loxP,通过促进对基因修饰的时空控制,2、3、 4.这些基因策略的结合创造了广泛的实验模型系统5,6,7。
基因工程小鼠模型(GEMMs)是评估单个基因或基因组如何影响哺乳动物发育和疾病的一个整体工具。在临床前癌症研究中,GEMM是研究癌症发展、进展和治疗的最具有生理相关性和严谨性的方法。我们的实验室专门生产癌症 GEMM 并将其定性。
在美国男性中,诊断出最高度的非皮癌是前列腺癌(PCa)。大多数 PCa 患者患有低风险疾病和高生存可能性,但当疾病在晚期诊断或有针对性的激素治疗导致进展到侵略性、不可治愈的 PCa 时,存活率急剧下降子类型9,10.我们的实验室已经开发出利用一个或多个肿瘤抑制基因的絮状等位基因的GEMM。肿瘤抑制基因表达的重组和丧失特别发生在前列腺,因为我们引入了一个转基因与Cre重组酶下游的前列腺启动子只激活在前列腺上皮细胞11,12.我们还培育了我们的 GEMM,以包含一种称为mT/mG的 Cre 报告者转基因,该转基因在缺乏 Cre 和绿色荧光蛋白 (GFP) 表达的细胞中诱导番茄荧光蛋白表达,在 Cre13的细胞中。虽然这种方法的介绍和我们具有代表性的结果表明,我们在实验室中研究的GEMM,该协议可用于从任何小鼠模型生成前列腺癌有机体。然而,正如我们在代表性结果部分详细讨论的那样,我们已经观察到某些肿瘤特征是前列腺癌有机体生成的最佳选择。
在过去的十年里,从上皮源组织培养细胞的新方法使我们在体外器官系统模型的能力上有了重大进步。术语”3D细胞培养”被归因于参与建立和维护器官的技术,一般可以定义为由细胞组成的结构,这些细胞由器官特异性细胞系驱动的二次结构驱动特征16.这些新方法不同于经典的二维细胞培养,因为细胞不需要转化或永生,无法长期生长;因此,正常细胞的3D培养可以与病变细胞进行比较。这在癌症研究中特别有价值,因为通常没有正常的细胞控制培养物。此外,有机体自发地形成具有适当分化细胞类型的二次组织架构,使它们成为比2D细胞系17更好的模型系统来理解体外癌症。我们的实验室从从我们的 PCa GEMM 中分离出肿瘤问题的 3D 有机体线,以补充我们的体内数据,并进行在 GEMM 中不可行的实验。
在本文中,我们提出了PCa GEMM的完整尸体解剖的书面和视觉协议,包括解剖不同的小鼠前列腺叶和转移性病变。我们描述并展示了一种从小鼠前列腺肿瘤中产生器官的分步方法,该方法基于Drost等人先前发表的从正常小鼠前列腺上皮组织18中衍生器官的规程。
Protocol
Representative Results
Discussion
前列腺肿瘤切除和器官生成协议中的关键步骤
去除非前列腺组织和小鼠前列腺肿瘤的精细解剖对于癌症器官的最佳生成至关重要,因为非前列腺上皮细胞和正常的前列腺上皮细胞都会生成有机体。特别是对于固体前列腺肿瘤,分离活肿瘤区域以去除坏死组织的污染至关重要,这样可以减少活细胞的数量。在有机物生成期间,应努力监测胶原酶的组织消化,因为长时间接触胶原酶会限制细?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢斯坦福大学的Calvin Kuo实验室提供HEK293细胞,这些细胞通过HA-小鼠Noggin-Fc或HA-mouse Rspo1-Fc进行稳稳的转染。我们还要感谢唐院长博士允许我们进入他实验室的荧光解剖显微镜。这项工作得到了国家癌症研究所的CA179907对D.W.G.的支持。罗斯威尔公园综合癌症中心的共享资源得到了国家卫生研究院癌症中心支持赠款 CA016056 的支持。
Materials
| 0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
