Generación de organoides tumorales a partir de modelos de ratón de ingeniería genética del cáncer de próstata
Summary
Mostramos un método para la necropsia y la disección de modelos de cáncer de próstata de ratón, centrándose en la disección tumoral de próstata. También se presenta un protocolo paso a paso para la generación de organoides tumorales de próstata de ratón.
Abstract
Los métodos basados en la recombinación homóloga para modificar genes han ido avanzando significativamente en la investigación biológica. Los modelos de ratón de ingeniería genética (GEMM) son un método riguroso para estudiar el desarrollo y la enfermedad de los mamíferos. Nuestro laboratorio ha desarrollado varios GEMMs de cáncer de próstata (PCa) que carecen de la expresión de uno o múltiples genes supresores de tumores utilizando el sistema de recombinas Cre-loxP específico del sitio y un promotor específico de la próstata. En este artículo, describimos nuestro método para la necropsia de estos GEM DeP PCa, centrándose principalmente en la disección de tumores de próstata de ratón. Los nuevos métodos desarrollados en la última década han facilitado el cultivo de células derivadas del epitelial para modelar sistemas de órganos in vitro en tres dimensiones. También detallamos un método de cultivo celular 3D para generar organoides tumorales a partir de GemM PCa de ratón. La investigación preclínica del cáncer ha estado dominada por el cultivo celular 2D y los modelos de xenoinjertos derivados de la línea celular o derivados del paciente. Estos métodos carecen de microambiente tumoral, una limitación del uso de estas técnicas en estudios preclínicos. Los GEMM son más fisiológicamente relevantes para entender la tumorigenesis y la progresión del cáncer. El cultivo organoide tumoral es un sistema modelo in vitro que recapitula la arquitectura tumoral y las características del linaje celular. Además, los métodos de cultivo celular 3D permiten el crecimiento de células normales para la comparación con los cultivos celulares tumorales, rara vez es posible utilizando técnicas de cultivo de células 2D. En combinación, el uso de GEMMs y cultivo de células 3D en estudios preclínicos tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la biología del cáncer.
Introduction
Desde finales de la década de 1980, la capacidad de alterar genes mediante la recombinación homóloga ha avanzado en gran medida el estudio de los sistemas biológicos1. Los sistemas promotores inducibles, tisulares o celulares específicos y las recombinaciones específicas del sitio, como Cre-loxP, tienen estudios genéticos avanzados al facilitar el control de las modificaciones genéticas tanto temporal como espacialmente2,3, 4. La combinación de estas estrategias genéticasha creado una amplia gama de sistemas de modelos experimentales 5,6,7.
Los modelos de ratón de ingeniería genética (GEM) son una herramienta integral para evaluar cómo los genes individuales o grupos de genes afectan el desarrollo y la enfermedad de los mamíferos. En la investigación preclínica del cáncer, los GEMM son el método más fisiológicamente relevante y riguroso para estudiar el desarrollo, progresión y tratamiento del cáncer8. Nuestro laboratorio se especializa en la generación y caracterización de GEM DeNado sin cáncer.
El cáncer no cutáneo más altamente diagnosticado entre los hombres en los Estados Unidos es el cáncer de próstata (PCa). La mayoría de los pacientes con PCa tienen enfermedad de bajo riesgo y alta probabilidad de supervivencia, pero las tasas de supervivencia disminuyen drásticamente cuando la enfermedad se diagnostica en etapas avanzadas o si la terapia hormonal dirigida induce la progresión a la PCa agresiva y no curable subtipos9,10. Nuestro laboratorio ha desarrollado GEMMs que utilizan alelos floxed de uno o más genes supresores de tumores. La recombinación y la pérdida de la expresión génica supresora tumoral se produce específicamente en la próstata porque hemos introducido un transgén con Cre recombinase aguas abajo del promotor probasin activado sólo en las células epiteliales de próstata11, 12. También hemos criado nuestros GEMMs para contener un transgén de reportero Cre llamado mT/mG, que induce la expresión de proteína fluorescente de tomate en células que carecen de Cre y proteína fluorescente verde (GFP) expresión en células con Cre13. Si bien la presentación de este método y nuestros resultados representativos muestran GEMMs que estudiamos en nuestro laboratorio, este protocolo se puede utilizar para generar organoides de cáncer de próstata a partir de cualquier modelo de ratón. Sin embargo, como se discutió en detalle en nuestra sección de resultados representativos, hemos observado que ciertas características tumorales son óptimas para la generación de organoides de cáncer de próstata.
En la última década, nuevos métodos de cultivo de células de tejidos de origen epitelial han dado lugar a avances significativos en nuestra capacidad de modelar sistemas de órganos in vitro14,15. El término “cultivo celular 3D” se ha atribuido a las técnicas involucradas en el establecimiento y mantenimiento de organoides, que generalmente pueden definirse como estructuras compuestas por células que ensamblan arquitectura secundaria impulsada por el linaje celular específico de órganos características16. Estos nuevos métodos son distintos del cultivo celular 2D clásico en que las células no requieren transformación o inmortalización para el crecimiento a largo plazo; por lo tanto, los cultivos 3D de células normales se pueden comparar con las células enfermas. Esto es particularmente valioso en la investigación del cáncer donde los cultivos normales de control celular no han estado típicamente disponibles. Además, los organoides forman espontáneamente arquitecturas de tejidos secundarios con tipos celulares adecuadamente diferenciados, lo que los convierte en un mejor sistema modelo para entender el cáncer in vitro que las líneas celulares 2D17. Nuestro laboratorio ha creado líneas organoides 3D a partir de problemas tumorales aislados de nuestros GemM PCa para complementar nuestros datos in vivo y realizar experimentos que no serían factibles en GEMMs.
En este artículo, presentamos protocolos escritos y visuales para la necropsia completa de los GEM DeP PCa, incluyendo la disección de diferentes lóbulos de la próstata del ratón y lesiones metastásicas. Describimos y mostramos un método paso a paso para generar organoides a partir de tumores de próstata de ratón basado en un protocolo publicado previamente por Drost et al. para derivar organoides del tejido epitelial de próstata de ratón normal18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos dentro del protocolo para la disección tumoral de próstata y la generación de organoides
La extirpación del tejido no prostático y la disección fina del tumor prostático del ratón es crucial para la generación óptima de organoides cancerosos, ya que tanto las células epiteliales no prostáticas como las células epiteliales normales de próstata generarán organoides. Para los tumores de próstata sólidos específicamente, es crucial aislar áreas de tumor viable para elimi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer al Laboratorio Calvin Kuo de la Universidad de Stanford por proporcionar células HEK293 establemente infectadas con Noggin-Fc o Rspo1-Fc de ratón HA. También nos gustaría dar las gracias al Dr. Dean Tang por permitirnos acceder al microscopio de disección fluorescente en su laboratorio. Este trabajo fue apoyado por CA179907 a D.W.G. del Instituto Nacional del Cáncer. Los recursos compartidos en Roswell Park Comprehensive Cancer Center fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Apoyo al Centro de Cáncer de Salud CA016056.
Materials
| 0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
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