Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

Summary

Nós descrevemos aqui métodos para a quantificação sensível e exata das lesões 8-oxo-7,8-dihydro-2 ‘-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n⁶-etheno-2 ‘-deoxyadenosine (1,n⁶-dAdo) e 1,n²– etheno-2′-deoxyguanosine (1,N₂-DGUO) no ADN. Os métodos foram aplicados na avaliação dos efeitos da matéria particulada fina ambiente (PM_2,5) nos tecidos (pulmão, fígado e rim) de camundongos a/J expostos.

Abstract

Os adutos do DNA e as bases oxidadas do ADN são exemplos das lesões do ADN que são biomarcadores úteis para a avaliação da toxicidade das substâncias que são electrophilic, geram eletrófilos reactivos em cima da biotransformação, ou induzem o stress oxidativo. Dentre as nucleobases oxidadas, a mais estudada é a 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxoGua) ou 8-oxo-7,8-dihidro-2 ‘-Desoxiguanosina (8-oxodGuo), um biomarcador de dano base oxidativamente induzido no DNA. Os aldeídos e os epoxyaldehydes resultantes do processo da peroxidação do lipido são as moléculas substituição capazes de dar forma aos adutos exocíclicas mutagénicas do ADN, tais como os adutos 1,n²-eteno-2′-deoxyguanosine do eteno (1,n²– εdGuo) e 1,n⁶-etheno-2 ‘-deoxyadenosine (1,n⁶-εdado), que foram sugeridos como biomarcadores potenciais na fisiopatologia da inflamação. Métodos seletivos e sensíveis para sua quantificação no DNA são necessários para o desenvolvimento de estratégias preventivas para retardar as taxas de mutação celular e o desenvolvimento crônico da doença (por exemplo, câncer, doenças neurodegenerativas). Entre os métodos sensíveis disponíveis para sua detecção (cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detectores de espectrometria de massas eletroquímicas ou em tandem, ensaio cometa, imunoensaios, ³²P-pós-rotulagem), os mais seletivos são aqueles baseados em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem (HPLC-ESI-MS/MS). A seletividade é uma vantagem essencial na análise de amostras biológicas complexas e a HPLC-ESI-MS/MS evoluiu como padrão-ouro para quantificação de nucleosídeos modificados em matrizes biológicas, como DNA, urina, plasma e saliva. O uso de padrões internos isotopicamente rotulados acrescenta a vantagem de correções para perdas de moléculas durante a hidrólise do DNA e as etapas de enriquecimento do analito, bem como para as diferenças da ionização do analito entre as amostras. Também auxilia na identificação do pico cromatográfico correto quando mais de um pico está presente.

Nós apresentamos aqui métodos sensíveis, exatos e precisos da HPLC-ESI-MS/MS validados que foram aplicados com sucesso para a quantificação de 8-oxodGuo, 1,n⁶-DAdo e 1,n²-dguo no ADN do pulmão, do fígado e do rim de ratos de A/J para a avaliação dos efeitos da exposição ambiental PM_2,5 .

Introduction

Algumas espécies reativas de oxigênio (ROS) são capazes de oxidar ligações duplas de carbono de bases de DNA e alguns carbonos na fração desoxirribose, gerando bases oxidadas e quebras de fio de DNA¹. Como uma molécula carregada negativamente rica em átomos de nitrogênio e oxigênio, o DNA também é um alvo para grupos eletrofílicos que reagem covalentemente com os sítios nucleofílicos (nitrogênio e oxigênio), dando produtos que são chamados de adutos de DNA². Assim, os adutos do ADN e as bases oxidadas do ADN são exemplos de lesões do ADN que são biomarcadores úteis para a avaliação da toxicidade das substâncias que são electrofílicas, geram eletrófilos reactivos em cima da biotransformação, ou induzem o stress oxidativo^1, o ². Embora as bases modificadas do ADN possam ser removidas do ADN pela base ou pelo reparo da excisão do nucleotide (BER ou NER), a indução de um desequilíbrio entre a geração e a remoção de lesões do ADN em favor do anterior conduz a um aumento líquido de seus níveis no tempo estipulado do ADN^{3 . Os resultados são o aumento das taxas de mutação do DNA, a redução da expressão gênica e a diminuição da atividade protéica2,4,5,6,7, efeitos que estão intimamente relacionados com a desenvolvimento de doenças. As mutações do DNA podem afetar diversas funções celulares, como sinalização celular, ciclo celular, integridade do genoma, estabilidade do telômero, epigenome, estrutura da cromatina, splicing de RNA, homeostase proteica, metabolismo, apoptose e diferenciação celular8 ,9. Estratégias para retardar as taxas de mutação celular e o desenvolvimento crônico da doença (por exemplo, câncer, doenças neurodegenerativas) passam pelo conhecimento das fontes de mutação, entre elas, as lesões do DNA e suas causas.}

ROS gerados endogenamente em excesso, devido à exposição ao poluente, inflamação persistente, fisiopatologia da doença (por exemplo, diabetes), etc., são causas importantes de dano da biomolécula, incluindo o DNA e o dano lipídico¹. Como exemplo, o radical hidroxila altamente reativo (OH) formado a partir de H₂O₂ redução por íons metálicos de transição (FE^{2 +},^{+ +}) oxida as bases de DNA, a fração de açúcar de DNA e os ácidos graxos poliinsaturados em controle de difusão taxas de¹⁰. Entre os 80 já caracterizados nucleobases oxidadas³, o mais estudado é 8-oxo-7,8-diidroguanina (8-oxoGua) ou 8-oxo-7,8-dihidro-2 ‘-Desoxiguanosina (8-oxodGuo, Figura 1), uma lesão que é capaz de induzir transversões gt em células mamíferas^10,11. É formado pela oxidação eletrônica mono da guanina, ou pelo ataque de oxigênio radical hidroxila ou singlet de guanina no DNA¹. Os ácidos graxos poliinsaturados são outros alvos importantes de oxidantes altamente reativos, como ^•Oh, que iniciam o processo de peroxidação lipídica^1,12. Ele dá origem a hidroperóxidos de ácidos graxos que podem se decompor a aldeídos eletrofílicos e epoxialdeídos, tais como malondialdeído, 4-hidroxi-2-nonenal, 2,4-decadienal, 4, 5-epóxi-(2E)-decenal, hexenal, acroleína, crotonaldeído, que são capaz de formar adutos de DNA exocílicos mutagénicos, como os adutos de malondialdeído, propano ou eteno^1,12,13. Os adutos de eteno 1,n²-eteno-2′-deoxyguanosine (1,n²-εdguo , Figura 1) e 1,n⁶-eteno-2 ‘-deoxyadenosine (1,n⁶-εdado, Figura 1 ) têm sido sugeridas como potenciais biomarcadores na fisiopatologia da inflamação^14,15.

Figura 1. Estruturas químicas das lesões de DNA quantificadas no presente estudo. dR = 2 ́-desoxirribose. Este número foi modificado de Oliveira et al.³⁴. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estudos realizados no início da década de 1980 permitiram a detecção sensível de 8-oxodGuo por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detecção eletroquímica (HPLC-ECD). A quantificação de 8-oxodguo por HPLC-ECD em diversos sistemas biológicos sujeitados às circunstâncias oxidantes conduziu ao Recognition de 8-oxodguo como um biomarcador de dano de base oxidativamente induzido no ADN^1,16. Embora robusto e permitindo a quantificação de 8-oxodguo na escala baixa de fmol¹⁷, as medidas do HPLC-ECD confiam na exatidão do tempo da retenção do analito para a identificação do analito e na definição da cromatografia para evitar interferências de outros constituintes da amostra. Como a detecção eletroquímica requer o uso de sal (por exemplo, fosfato de potássio, acetato de sódio) na fase móvel, a manutenção de condições analíticas adequadas precisa de rotina de coluna e tempo de limpeza do equipamento.

Alternativamente, o uso do DNA bacteriano da enzima de reparo do ADN glicosilase do formamidopyrimidine (fpg) e, mais tarde, o glicolisase 1 do humano 8-oxoguanine (hOGG1), para a deteção e a remoção de 8 oxogua do ADN, emergiu como uma maneira para a indução do lábil do alcalóide do ADN Sites. Os locais lábeis do alcalóide são convertidos às rupturas da costa do ADN e permitem a quantificação indireta muito elevada sensível de 8 oxoGua pela electroforese alcalina do gel da única pilha (“ensaio do cometa”). A alta sensibilidade e a realização das análises sem a necessidade de extração de DNA celular são as principais vantagens deste tipo de ensaio. Dá os níveis os mais baixos do estado estacionário de 8 oxoGua no ADN, tipicamente 7-10 vezes mais baixos do que os níveis obtidos por métodos bioanalíticos baseados no HPLC. No entanto, é uma medida indireta de 8-oxogua e algumas desvantagens são a falta de especificidade ou a eficiência desconhecida das enzimas de reparo utilizadas^1,16,18.

Os imunoensaios são outro conjunto de métodos utilizados para a detecção de 8-oxoGua¹ e ADUTOS de DNA exocídrico, como 1,n⁶-dAdo e 1,n²-dguo¹². Apesar da sensibilidade, uma lacuna do uso de anticorpos para a detecção de lesões de DNA é a falta de especificidade devido à reatividade cruzada a outros componentes de amostras biológicas, incluindo as bases normais de DNA^1,12. Os adutos exocílicos de DNA, incluindo 1, n⁶-DAdo e 1, n²-dguo, também podem ser detectados e quantificados por ensaios altamente sensíveis de ³²P-postetiquetagem¹². A sensibilidade elevada de ³²P-postrotulagem permite o uso de quantidades muito pequenas de ADN (por exemplo, 10 μg) para a deteção de aproximadamente 1 aduto por 10¹⁰ bases normais¹⁹. No entanto, o uso de radioquímicos, a falta de especificidade química e a baixa acurácia são algumas desvantagens^19,20.

Uma limitação compartilhada dos métodos citados acima é a baixa seletividade ou especificidade para a detecção das moléculas desejadas. Nesse cenário, a HPLC acoplada à espectrometria de massas em tandem de ionização por electrospray (HPLC-ESI-MS/MS e HPLC-MS³) evoluiu como padrão-ouro para quantificação de nucleosídeos modificados em matrizes biológicas, como DNA, urina, plasma e saliva ^{1. º , 19} anos de ^{, 20}. vantagens dos métodos de HPLC-ESI-MS/MS são a sensibilidade (tipicamente na baixa escala do fmol) e a especificidade elevada fornecida por i) a separação cromatográfica, II) o teste padrão característico e conhecido da fragmentação da molécula dentro da massa Câmara de colisão do espectrómetro, e III) a medida exata da massa selecionada para carregar a relação (m/z) no modo múltiplo da monitoração da reação^1,19. O uso de padrões internos isotopicamente rotulados acrescenta a vantagem de correções para perdas de moléculas durante a hidrólise do DNA e as etapas de enriquecimento do analito, bem como para as diferenças da ionização do analito entre as amostras. Auxilia também na identificação do pico cromatográfico correto quando mais de um pico está presente^1,12,19,20.

Vários métodos baseados em HPLC-ESI-MS/MS têm sido utilizados para quantificação de 8-oxodguo, 1,n⁶-dAdo e 1,n²-dguo em DNA extraído de diferentes amostras biológicas^{12,15,20 ,21,22,23,24,25,26},^27,28,29 . Partículas finas (PM_2,5) transportar produtos químicos orgânicos e inorgânicos, tais como hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHS), Nitro-PAHS, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, quinolinas, metais e íons solúveis em água, que podem induzir inflamação e estresse oxidativo, condições que favorecem a ocorrência de danos biomoléculas e doença^30,31,32,33. Nós apresentamos aqui métodos validados de HPLC-ESI-MS/MS que foram aplicados com sucesso para a quantificação de 8-oxodGuo, de 1, den⁶-dAdo e de 1, den²-dguo no ADN do pulmão, do fígado e do rim de ratos de a/J para a avaliação do efeitos do ambiente PM_2,5 exposição³⁴.

Protocol

Camundongos a/J machos de quatro semanas de idade, sem patógenos específicos, foram obtidos do centro reprodutor de animais de laboratório da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil, e foram tratados de acordo com o Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade de São Paulo (protocolo n º 1310/09). 1. coleção de tecidos de camundongos Anestesie o animal com xilazina e cetamina. Para um rato com 30 g de peso corporal, injete uma soluç?…

Representative Results

As concentrações médias de DNA (± DP) obtidas do fígado de camundongos (tecido ~ 1 g), pulmão (tecido de ~ 0,2 g) e rim (tecido ~ 0,4 g) foram, respectivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 e 3.223 ± 723 μg/mL no volume final de 200 μL. Um cromatograma representativo obtido por HPLC-DAD do DNA purificado é mostrado na Figura 3. A presença dos quatro 2 ‘-deoxynucleosides, livre dos ribonucleosides do RNA, que eluir imediatamente antes dos 2 ‘-deox…

Discussion

Um problema principal encontrado nas análises 8-oxodguo por métodos da HPLC é a indução possível de sua formação durante os procedimentos do workup da extração do ADN, da hidrólise do ADN, e da concentração de hidrolisados do ADN^22,38. A fim de minimizar o problema da formação vesícula 8-oxodguo, recomenda-se a adição de deferoxamina a todas as soluções de extração de DNA, armazenamento e hidrólise, o uso do método de iodeto de sódio agen…

Materials

[15N5]-2’-deoxyadenosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3899-CA-10
acetonitrile	Carlo Erba Reagents	412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa	Sigma	P5521
ammonium acetate	Merck	101116
calf thymus DNA	Sigma	D1501
cell lysis solution	QIAGEN	158908
chloroform	Carlo Erba Reagents	412653
deferoxamine	Sigma	D9533
deoxyribonuclease I (DNase I)	Bio Basic Inc	DD0649
ethanol	Carlo Erba Reagents	414542
formic acid	Sigma-Aldrich	F0507
HPLC-ESI-MS/MS system	HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments	HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system	Shimadzu	Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18)	Phenomenex	00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18)	Phenomenex	00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18)	Phenomenex	00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)	Phenomenex	AJO-4287
isoamyl alcohol	Sigma-Aldrich	M32658
isopropyl alcohol (isopropanol)	Carlo Erba Reagents	A412790010
ketamine	Ceva	Commercial name: Dopalen
magnesium chloride	Carlo Erba Reagents	349377
magnesium chloride	Sigma	M2393
methanol	Carlo Erba Reagents	L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox	Sigma	P4506
protein precipitation solution	QIAGEN	158912
proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308
ribonuclease A	Sigma	R5000
sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
SPE-C18 (Strata-X)	Phenomenex	8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Carlo Erba Reagents	489983
xylazine	Syntec do Brasil	Commercial name: Xilazin