Het induceren en karakteriseren van vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen

Summary

In deze studie beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het induceren van lever vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen met het vetzuur zout natriumoleaat en gebruiken we methoden voor de detectie en kwantificering van lipide accumulatie, inclusief coherente anti-Stokes Raman verstrooiing (AUTO’S) microscopie, cytofluorimetrische analyse, olie rood O kleuring, en qPCR.

Abstract

Hepatische steatose vertegenwoordigt een metabole dysfunctie die voortvloeit uit een accumulatie van triglyceride-bevattende lipide druppeltjes in hepatocyten. Overmatige vetophoping leidt tot niet-alcoholische vette leverziekte (NAFLD), die mogelijk omkeerbaar is en kan evolueren naar niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH) en uiteindelijk cirrose en hepatocellulair carcinoom (HCC). De moleculaire mechanismen die de accumulatie van lipiden in hepatocyten koppelen aan de progressie naar NASH, onomkeerbare leverbeschadiging, fibrose, cirrose en zelfs HCC blijven onduidelijk. Hiervoor zijn verschillende in vitro en in vivo modellen ontwikkeld om de pathologische processen te verheldigen die NAFLD veroorzaken. In de huidige studie beschrijven we een cellulair model voor de inductie van vesiculaire steatose van de lever die bestaat uit DMSO-gedifferentieerde humane hepatische HepaRG cellen behandeld met het vetzuur zout natriumoleaat. Inderdaad, natriumoleaat-behandelde HepaRG cellen accumuleren lipide druppeltjes in het cytoplasma en vertonen typische kenmerken van steatose. Dit in vitro menselijk model vertegenwoordigt een waardevol alternatief voor in vivo muizen modellen en de primaire menselijke hepatocyten. We presenteren ook een vergelijking van verschillende methoden voor de kwantificering en evaluatie van vetophoping in HepaRG cellen, waaronder olie rode O-kleuring, cytofluorimetrische Bodipy-meting, metabolische genexpressie analyse door qPCR en coherente anti-Stokes Raman verstrooiing (AUTO’S) microscopie. CARS imaging combineert de chemische specificiteit van Raman-spectroscopie, een chemische analysetechniek die bekend staat in de toepassingen van materiaalwetenschappen, met de voordelen van hoge-snelheid, hoge-resolutie niet-lineaire optische microscopie om nauwkeurige kwantificering van lipide accumulatie en lipide druppel dynamiek. De invoering van een efficiënt in vitro model voor de inductie van vesiculaire steatose, naast een nauwkeurige methode voor de kwantificering en karakterisering van lipide accumulatie, kan leiden tot de ontwikkeling van vroege fase diagnose van NAFLD via de identificatie van moleculaire markers en het genereren van nieuwe behandelstrategieën.

Introduction

Hepatische steatose wordt gedefinieerd als Intrahepatische vet accumulatie, binnen triglyceride-bevattende lipide druppeltjes, van ten minste 5% van de lever gewicht. Langdurige hepatische lipide-opslag is een potentieel omkeerbaar proces, echter, het kan leiden tot lever metabole dysfunctie, ontsteking en geavanceerde vormen van niet-alcoholische vette leverziekte (NAFLD), de overheersende oorzaak van chronische leverziekte in vele delen van de wereld^1,2. Nafld is een multifactoriële ziekte die kan evolueren naar de agressievere niet-alcoholische Steatohepatitis (Nash), die op zijn beurt kan vorderen naar cirrose en, bij een klein percentage van de patiënten, tot hepatocellulair carcinoom (HCC)^1,3. Er is momenteel geen goedgekeurde therapie beschikbaar als een specifieke behandeling voor nafld en de combinatie van dieet-en leefstijl modificaties blijft de pijler van nafld en Nash Management^4,5,6.

De moleculaire mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van hepatische steatose in de pathogenese van NAFLD moeten nog steeds worden opgehelderd⁷. In deze context zijn Muismodellen ontwikkeld om de progressie van de ziekte van de menselijke steatose te bestuderen. Een groot aantal verschillende modellen bestaat, en elk heeft zijn voor-en nadelen, met inbegrip van genetische, nutritionele en chemisch geïnduceerde modellen combineren verschillende benaderingen. Genetisch gemodificeerde (transgene of knock-out) muizen ontwikkelen spontaan leverziekte. Opgemerkt moet echter worden dat deze mutaties zeer zeldzaam zijn bij mensen en dat het verwijderen of overexpressie van een enkel gen (bijv. ob/ob-muis) de etiologie van de multifactoriële menselijke ziekte niet nabootsen op moleculair niveau^8,9. Evenzo, de ziekte verworven door muizen na dieet of farmacologische manipulatie kan niet nabootsen van de effecten van menselijke diëten in verband met de ontwikkeling van NAFLD in man⁸. Diermodellen hebben echter de ontwikkelingen in het begrip van NAFLD vergemakkelijkt en deze aanpak is momenteel de meest gebruikte strategie in laboratoriumonderzoek. Niettemin, de replicatie bij mensen van resultaten verkregen in diermodellen herhaaldelijk is mislukt, waardoor slechte vertaling in de kliniek¹⁰.

Daarom kunnen in vitro modellen van NAFLD een fundamentele rol spelen in het verhelderend maken van de moleculaire mechanismen van NAFLD progressie, en ze vertegenwoordigen een waardevol hulpmiddel om een groot aantal verbindingen te schermen. Primaire celculturen, vereeuwigd cellijnen en lever biopsieën zijn uitgebreid gebruikt voor onderzoeksdoeleinden¹¹. Primaire menselijke hepatocyten nauw lijken op menselijke klinische voorwaarden, maar er is een beperkt aantal donoren, en primaire celculturen vertonen slechte reproduceerbaarheid als gevolg van de variabiliteit van de cellen. Deze observaties, samen met ethische en logistieke kwesties, hebben geresulteerd in het gebruik van menselijke primaire hepatocyten wordt beperkt¹². Dus, hepatische cellijnen vertegenwoordigen een handig alternatief, met een aantal essentiële voordelen ten opzichte van de primaire cultuur, als hepatische cellijnen groeien gestaag, hebben een bijna onbeperkte levensduur, en hebben een stabiel fenotype. Bovendien, cellijnen zijn gemakkelijk toegankelijk en de cultuur voorwaarden van hepatische cellijnen zijn eenvoudiger dan die van primaire hepatocyten en zijn gestandaardiseerd tussen verschillende laboratoria.

Hier beschrijven we in detail een in vitro cel-gebaseerd model van lever vesiculaire steatose, vertegenwoordigd door hepatische gedifferentieerde HepaRG cellen behandeld met het vetzuur natriumoleaat. De HepaRG cellijn werd opgericht van een vrouwelijke patiënt beïnvloed door hepatitis C infectie en een Edmondson Grade I goed gedifferentieerde lever tumor¹⁴. De HepaRG-cellijn is een humane bipotente voorlopercellen die kunnen differentiëren bij blootstelling aan 2% dimethylsulfoxide (DMSO) in de richting van twee verschillende fenotypes van de cel: biliaire-achtige en Hepatocyt-achtige. Gedifferentieerde HepaRG cellen (dHepaRG) delen sommige functies en eigenschappen met volwassen hepatocyten en bezitten de mogelijkheid om stabiel lever-specifieke genen zoals albumine, AldolaseB, cytochroom P450 2E1 (CYP2E1), en cytochroom P450 3A4 (CYP3A4)¹³ (stap 3). Behandeling van dheparg cellen met het vetzuur zout natriumoleaat (250 μM) voor 5 dagen leiden tot de generatie van cytoplasmatische lipide druppeltjes, nabootsen van de effecten van vette lever^14,15,17,18 ( stap 4). Accumulatie van lipide druppeltjes kan gemakkelijk worden gedetecteerd door olie rood O kleuring (stap 5), een lysochroom vetoplosbare kleurstof die neutrale triglyceriden en lipiden rood-oranje vlekken. Om efficiënt kwantificeren lipiden in vette dHepaRG, hier illustreren we cytofluorimetrische analyse na kleuring met 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-Bora-3a, 4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (stap 6), een lipofiele fluorescerende sonde die lokaliseert aan intracellulaire lipide lichamen en is gebruikt voor het labelen van lipide druppels¹⁹. Bovendien laten we hier zien hoe de steatose te evalueren door kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) (stap 7) genexpressie deregulering van verschillende metabole genen in dHepaRG cellen. Om de accumulatie van lipide druppeltjes na de behandeling met natriumoleaat verder te karakteriseren en te kwantificeren, voerden we coherente anti-Stokes Raman verstrooiing (AUTO’S) microscopie (stap 8), een innovatieve techniek die de visualisatie en kwantificering van lipide druppeltjes zonder labeling^20,21.

Protocol

1. bereiding van de kweek media en reagentia Prolifererend medium: supplement William’s E medium met GlutaMAX, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicileen/streptomycine, 5 μg/mL insuline en 0,5 μM hydrocortison hemisuccinaat. Differentiatie medium: supplement William’s E medium met GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicileen/streptomycine, 5 μg/mL insuline, 50 μM hydrocortison hemisuccinaat en 2% DMSO. Vries medium: supplement prolifererend medium met 10% DMSO. Natriumoleaat: oplossen in…

Representative Results

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het induceren en karakteriseren van vesiculaire steatose in DMSO-gedifferentieerde HepaRG cellen door natriumoleaat behandeling (Figuur 1A). Differentiatie van HepaRG cellen.Om differentiatie efficiënt te induceren, moeten prolifererende cellen worden gescheiden bij een lage dichtheid (2,5 x 104 cellen/cm2) in het proliferatie medium. Bij een lage dich…

Discussion

Dit protocol beschrijft hoe u de Heparylcellen onderscheidt en hoe u vesiculaire steatose door natriumoleaat behandeling induceert (Figuur 1A). Sterker nog, in vergelijking met andere humane hepatocellulaire carcinoom (HCC) cellijnen vertoont de heparg cellijn kenmerken van volwassen humane hepatocyten, die een waardevol alternatief vertegenwoordigen voor ex vivo gecultiveerde primaire humane hepatocyten^{13,14 ,…}

Materials

Hyclone HyClone Fetal Clone II	GE Healthcare	SH30066
William’s E medium with GlutaMAX	Thermofisher	32551087
Penicillin/streptomycin	SIGMA	P4333
Insulin	SIGMA	I9278
hydrocortisone hemisuccinate	SIGMA	H2270
DMSO, dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2438
Sodium Oleate	SIGMA	O7501
Methanol	SIGMA	179337
Isopropanol	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
Formaldehyde solution	SIGMA	252549
RNAse free DNAseI	Promega	M198A
Glass-bottomed dishes	Willco Wells	GWST-5040
Oil Red solution	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR oligo name	Sequence
ACACB FOR	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
b-actin FOR	GCACTCTTCCAGCCTTCCT
b-actin REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FOR	TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV	AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FOR	CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV	GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FOR	TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV	GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FOR	TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV	CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR	CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV	TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR	TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV	AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR	TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV	ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FOR	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV	ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FOR	ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV	TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FOR	TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV	CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FOR	AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REV	GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR	TCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REV	TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FOR	TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV	CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FOR	CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV	TTGGCAAATGCTTTCGCTC