분화된 HepaRG 세포에서 베아토시스 유도 및 특성화
Summary
본 연구에서는, 지방산 염 나트륨 올레아테를 사용하여 분화된 HepaRG 세포에서 간 용술증을 유도하기 위한 상세한 프로토콜을 설명하고, 일관된 항스톡스를 포함한 지질 축적의 검출 및 정량화를 위한 방법을 채택한다. 라만 산란 (CARS) 현미경 검사법, 세포 형광 분석, 오일 레드 O 염색, 및 qPCR.
Abstract
간 지방 세포는 간세포에 트리글리세라이드 함유 지질 방울의 축적에서 발생하는 대사 기능 장애를 나타냅니다. 과도한 지방 축적은 잠재적으로 가역적이고 비 알코올 성 지방 간염 (NASH) 및 결국 간경변 및 간세포 암종 (HCC)으로 진화 할 수있는 비 알코올 성 지방 간 질환 (NAFLD)으로 이어집니다. NASH에 진행과 간세포에서 지질 축적을 연결 하는 분자 메커니즘, 돌이킬 수 없는 간 손상, 섬유 증, 간 경 변, 그리고 심지어 HCC 는 여전히 불분명 남아. 이를 위해, 몇몇 생체외 및 생체내 모형은 NAFLD를 일으키는 원인이 되는 병리학 적인 프로세스를 해명하기 위하여 개발되었습니다. 본 연구에서, 우리는 지방산 염 나트륨 올레아테로 처리된 DMSO 분화 인간 간 HepaRG 세포로 구성된 간 소포증의 유도를 위한 세포 모델을 기술한다. 실제로, 나트륨 올레아테 처리 된 HepaRG 세포는 세포질에 지질 방울을 축적하고 스테토시스의 전형적인 특징을 보여줍니다. 이러한 시험관내 인간 모델은 생체내 마우스 모델뿐만 아니라 1차 인간 간세포에 대한 귀중한 대안을 나타낸다. 우리는 또한 오일 레드 O 염색, 세포 불변 보디피 측정, qPCR에 의한 대사 유전자 발현 분석 및 일관된 항 스토크스를 포함한 HepaRG 세포의 지방 축적의 정량화 및 평가를 위한 여러 가지 방법의 비교를 제시합니다. 라만 산란 (CARS) 현미경 검사법. CARS 이미징은 재료 과학 응용 분야에서 잘 알려진 화학 분석 기술인 라만 분광법의 화학적 특이성과 정밀한 정밀성을 허용하는 고속, 고해상도 비선형 광학 현미경의 이점을 결합합니다. 지질 축적 및 지질 방울 역학의 정량화. 혈관 성 증의 유도를위한 효율적인 시험관 내 모델의 설립, 지질 축적의 정량화 및 특성화에 대한 정확한 방법과 함께, 통해 NAFLD의 조기 진단의 개발로 이어질 수 분자 마커의 식별, 새로운 치료 전략의 생성에.
Introduction
간 지방 증은 간 지방 축적으로 정의 됩니다., 트리 글리세라이드 를 포함 하는 지질 방울 내에서, 적어도의 5% 간 무게의. 장기간 된 간 지질 저장은 잠재적으로 가역적인 과정, 그러나, 그것은 간 대사 기능 장애로 이어질 수 있습니다., 염증 및 비 알코올 지방 간 질환의 고급 형태 (NAFLD), 많은 부분에서 만성 간 질환의 주요 원인 세계1,2. NAFLD는 더 공격적인 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진화할 수 있는 다인성 질환으로, 이는 차례로 간경변으로 진행될 수 있고, 환자의 작은 비율로, 간세포암종(HCC)1,3. 아니 승인 된 치료는 NAFLD에 대한 특정 치료로 현재 사용할 수 있으며 식이 요법과 라이프스타일 수정의 조합은 NAFLD 및 NASH 관리의 기둥 남아 4,5,6.
NAFLD의 병인에서 간 지방증의 발달로 이어지는 분자 메커니즘은 여전히 해명 될 남아7. 이러한 맥락에서, 마우스 모델은 인간 steatosis 질병 진행을 연구하기 위해 개발되었다. 다른 모형의 무수한 존재하고, 각각은 다른 접근을 결합하는 유전, 영양 및 화학적으로 유도한 모형을 포함하여 그것의 장단점이 있습니다. 유전자 변형 (형질 전환 또는 녹아웃) 마우스는 자발적으로 간 질환을 개발합니다. 그러나, 이러한 돌연변이는 인간에서 매우 드물며 단일 유전자(예를 들어, ob/ob 마우스)의 삭제 또는 과발현은 분자 수준8,9에서다인성 인간 질환의 병인을 모방하지 않을 수 있다는 점에 유의해야 한다. 마찬가지로, 식이 요법 이나 약리학 조작 후 쥐에 의해 취득 된 질병은 남자 8에서NAFLD의 발달과 관련된 인간의 식단의 효과를 모방하지 않을 수 있습니다. 동물 모형은, 그러나, NAFLD의 이해에 있는 발달을 촉진하고 이 접근은 현재 실험실 연구에서 가장 빈번히 이용되는 전략입니다. 그럼에도 불구하고, 동물 모델에서 얻은 결과의 인간에서의 복제는 반복적으로 실패하여, 클리닉(10)으로의 번역이 불량하게 되었다.
따라서, NAFLD의 시험관내 모델은 NAFLD 진행의 분자 메커니즘을 해명시키는 데 근본적인 역할을 할 수 있으며, 이들은 많은 수의 화합물을 스크리크하는 귀중한 도구를 나타낸다. 1 차적인 세포 배양, 불멸의 세포주 및 간 생검은 연구 목적을 위해 광범위하게 이용되었습니다11. 1 차적인 인간 간세포는 밀접하게 인간 임상 조건과 유사합니다, 그러나 기증자의 한정된 수가 있고, 1 차적인 세포 배양은 세포의 가변성 때문에 나쁜 재현성을 보여줍니다. 이러한 관찰, 윤리적 및 물류 문제와 함께, 인간의 기본 간세포의 사용은 제한되는 결과12. 따라서, 간 세포주들은 간 세포주들이 꾸준히 성장함에 따라 1차 배양에 비해 몇 가지 필수적인 장점을 가지며, 거의 무제한의 수명을 가지며, 안정적인 표현형을 가지는 편리한 대안을 나타낸다. 더욱이, 세포주 쉽게 접근할 수 있고 간 세포주 배양 조건은 1 차적인 간세포의 그것 보다는 더 간단하고 다른 실험실 중 표준화됩니다.
여기서, 우리는 지방산 나트륨 올레아테로 처리된 간 분화 HepaRG 세포로 대표되는 간 베아실 지방증의 체외 세포 기반 모델을 상세히 기술한다. HepaRG 세포주C형 간염 감염및 에드먼드슨 급I의 잘 분화된 간종양(14)에 의해 영향을 받는 여성 환자로부터 확립되었다. HepaRG 세포주 2% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 노출시 분화 할 수있는 인간 이중 성 전구 세포주 두 개의 상이한 세포 표현형: 담즙 같은 및 간세포 유사 세포. 분화된 HepaRG 세포(dHepaRG)는 성인 간세포와 몇 가지 특징과 특성을 공유하고 알부민, 알돌라세비, 시토크롬 P450 2E1(CYP2E1) 및 시토크롬 P450 3A4(CYP3A4) 13과 같은 간 특이적 유전자를 안정적으로 발현할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. (3단계)를 참조하십시오. 지방산 염나트륨 올레아테(250 μM)를 5일간 사용하여 dHepaRG 세포를 치료하면 세포질 지질 방울의 생성으로 이어지며, 지방간14,15,17,18의 효과를 모방한 것이다. 4단계). 지질 방울의 축적은 오일 레드 O 염색에 의해 쉽게 검출 될 수있다 (단계 5), 중성 트리글리세라이드와 지질 적색 오렌지를 얼룩 리소크롬 지방 수용성 염료. 지방 dHepaRG에서 지질을 효율적으로 정량화하기 위해, 여기에서 우리는 4,4-디플루오로-1,3,5,7-tetramethyl-4-보라-3a,4a-디아자-s-indacene (보디피 505/515)(단계 6), 립성 프로브로 염색 한 후 세포 불용형 분석을 보여줍니다. 세포 내 지질 체및 지질 방울 라벨에 사용 되었습니다19. 더욱이, 여기서 우리는 dHepaRG 세포에서 여러 대사 유전자의 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) (단계 7) 유전자 발현 완화에 의해 세포증을 평가하는 방법을 보여준다. 올레아테 나트륨 처리 후 지질 방울의 축적을 더욱 특성화하고 정량화하기 위해, 우리는 일관된 안티 스토크스 라만 산란 (CARS) 현미경 검사법 (단계 8)을 수행, 시각화 및 정량화를 가능하게하는 혁신적인 기술 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 HepaRG 세포를 분화하는 방법과 올레아테나트륨 처리에 의한 포수체 증시를 유도하는 방법을 설명한다(도1A). 실제로, 다른 인간 간세포암(HCC) 세포주와 비교하여, 헤파RG 세포주들은 성인 인간 간세포의 특징을 나타내며, 생체내 배양 된 1차 인간 간세포에 대한 귀중한 대안을 나타내는13,14 ,<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 친절하게 HepaRG 세포를 제공 크리스티안 트레포 교수 (INSERM U871, 리옹, 프랑스)에게 감사드립니다. 우리는 행정 도움을 리타 Appodia에 감사드립니다. 이 작품은 MIUR- 장관 델 istruzione, dell’università e 델라 ricerca (FIRB 2011-2016 RBAP10XKNC) 로마의 사피엔자 대학 (prot)에 의해 지원되었다. C26A13T8PS; 제자. C26A142MCH; 제자. C26A15LSXL).
Materials
| Hyclone HyClone Fetal Clone II | GE Healthcare | SH30066 | |
| William’s E medium with GlutaMAX | Thermofisher | 32551087 | |
| Penicillin/streptomycin | SIGMA | P4333 | |
| Insulin | SIGMA | I9278 | |
| hydrocortisone hemisuccinate | SIGMA | H2270 | |
| DMSO, dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2438 | |
| Sodium Oleate | SIGMA | O7501 | |
| Methanol | SIGMA | 179337 | |
| Isopropanol | SIGMA | 278475 | |
| BODIPY 505/515 | Thermofisher | D3921 | |
| PBS | Thermofisher | 14190-250 | |
| Formaldehyde solution | SIGMA | 252549 | |
| RNAse free DNAseI | Promega | M198A | |
| Glass-bottomed dishes | Willco Wells | GWST-5040 | |
| Oil Red solution | SIGMA | O625 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution | Promega | G3582 | |
| q-PCR oligo name | Sequence | ||
| ACACB FOR | CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA | ||
| ACACB REV | CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG | ||
| b-actin FOR | GCACTCTTCCAGCCTTCCT | ||
| b-actin REV | AGGTCTTTGCGGATGTCCAC | ||
| ALBUMIN FOR | TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG | ||
| ALBUMIN REV | AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC | ||
| ALDOB FOR | GCATCTGTCAGCAGAATGGA | ||
| ALDOB REV | TAGACAGCAGCCAGGACCTT | ||
| APOB FOR | CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG | ||
| APOB REV | CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA | ||
| APOC3 FOR | CTCAGCTTCATGCAGGGTTA | ||
| APOC3 REV | GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG | ||
| CPT1A FOR | TCATCAAGAAATGTCGCACG | ||
| CPT1A REV | GCCTCGTATGTGAGGCAAAA | ||
| CYP2E1 FOR | TTGAAGCCTCTCGTTGACCC | ||
| CYP2E1 REV | CGTGGTGGGATACAGCCAA | ||
| CYP3A4 FOR | CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT | ||
| CYP3A4 REV | TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA | ||
| GAPDH FOR | TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | ||
| GAPDH REV | AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC | ||
| GPAM FOR | TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT | ||
| GPAM REV | ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA | ||
| IL6 FOR | CCTGAACCTTCCAAAGATGGC | ||
| IL6 REV | ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG | ||
| PDK4 FOR | ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC | ||
| PDK4 REV | TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG | ||
| PLIN2 FOR | TTGCAGTTGCCAATACCTATGC | ||
| PLIN2 REV | CCAGTCACAGTAGTCGTCACA | ||
| PLIN4 FOR | AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC | ||
| PLIN4 REV | GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC | ||
| SCD FOR | TCTAGCTCCTATACCACCACCA | ||
| SCD REV | TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC | ||
| SLC2A1 FOR | TGCTCATCAACCGCAACGAG | ||
| SLC2A1 REV | CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG | ||
| 18S FOR | CGCCGCTAGAGGTGAAATTC | ||
| 18S REV | TTGGCAAATGCTTTCGCTC |
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