גרימת ואפיון שלפוחית הזרע ב הבדיל תאים HepaRG
Summary
במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לגרימת הכבד שלפוחית השומן בתאי HepaRG עם חומצות שומן מלח נתרן לרדוף ולהעסיק שיטות זיהוי וכימות של הצטברות שומנים בדם, כולל anti-סטוקס קוהרנטי פיזור ראמאן (מכוניות) מיקרוסקופ, ניתוח ציטופלוורימטרי, שמן אדום כתמים ו-qPCR.
Abstract
סטרומטוזיס הכבד מייצגת תפקוד מטבולי הנובע מהצטברות של שומנים בטריגליצרידים המכילים טיפות השומנים ב hepatocytes. הצטברות שומן מוגזמת מוביל מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים (NAFLD), אשר עשוי הפיך עלול להתפתח שאינם אלכוהוליים steatohepatitis (נאש) ובסופו של דבר שחמת ו hepatocellular קרצינומה (HCC). המנגנון המולקולרי המקשר הצטברות השומנים ב hepatocytes עם ההתקדמות לנאש, נזק כבד בלתי הפיך, פיברוזיס, שחמת, ואפילו HCC עדיין נשאר ברור. לשם כך פותחו מספר מvivo ובדגמים מסוימים כדי להבהיר את התהליכים הפתולוגיים הגורמים לNAFLD. במחקר הנוכחי, אנו מתארים מודל הסלולר עבור אינדוקציה של הכבד שלפוחית השומן המורכבת של DMSO-הבדיל האנושי הכבד HepaRG תאים שטופלו עם חומצת שומן מלח נתרן לאואט. אכן, נתרן oleate התייחס התאים HepaRG לצבור טיפות השומנים בציטופלסמה ולהראות תכונות טיפוסיות של steatosis. זה במודל אנושי מתורבת מייצג חלופה רבת ערך לדגמי עכברים vivo, כמו גם לגוף הפטוציטים האנושי העיקרי. אנו מציגים גם השוואה של מספר שיטות עבור כימות והערכה של הצטברות שומן בתאי HepaRG, כולל שמן אדום כתמים, ציטופלוורימטרית מדידה Bodipy, ביטוי גנים מטבולית ניתוח ידי qPCR, ואנטי-סטוקס קוהרנטי פיזור ראמאן (מכוניות) מיקרוסקופ. הדמיה מכוניות משלבת את הספציפיות הכימי של ספקטרוסקופיית ראמאן, טכניקת ניתוח כימי הידוע היטב ביישומים המדע, עם היתרונות של במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה לא ליניארי מmicroscopies כדי לאפשר מדויק קוונפיקציה של הצטברות השומנים ו-droplet השומנים. הקמתה של מודל מתורבת יעיל עבור אינדוקציה של שלפוחית העין, לצד שיטה מדויקת עבור כימות ואפיון של הצטברות שומנים בדם, יכול להוביל לפיתוח של אבחנה בשלב מוקדם של nafld דרך ה זיהוי של סמנים מולקולריים, וליצירת אסטרטגיות טיפול חדשות.
Introduction
סטרומטוזיס הכבד מוגדר הצטברות שומן תוך-הכבד, בתוך הטריגליצרידים המכיל טיפות השומנים, של לפחות 5% ממשקל הכבד. אחסון ממושך השומנים הכבד הוא תהליך הפיך פוטנציאלי, אולם, זה יכול להוביל לתפקוד מטבולית בכבד, דלקת וצורות מתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (nafld), הגורם השולט של מחלת כבד כרונית בחלקים רבים של העולם1,2. Nafld היא מחלה רב עצרת אשר עשוי להתפתח אגרסיבי יותר שאינם אלכוהוליים steatohepatitis (נאש), אשר בתורו יכול להתקדם שחמת, באחוז קטן של חולים, כדי קרצינומה של hepatocellular (HCC)1,3. טיפול לא מאושר זמין כרגע כטיפול ספציפי עבור nafld ושילוב של דיאטה ושינויים בסגנון חיים נשאר העמוד של הניהול nafld ו נאש4,5,6.
המנגנונים המולקולריים שהובילו להתפתחות הסטירומטוזיס הכבד בפתוגנזה של NAFLD עדיין נשארים להסבר7. בהקשר זה, מודלים העכבר פותחו כדי ללמוד התקדמות המחלה מחלת האדם. מספר רב של דגמים שונים קיימים, ולכל אחד יש יתרונות וחסרונות, כולל מודלים גנטיים, תזונתיים וכימיים שונים המשלבים גישות שונות. עכברים ששונו גנטית (הטרנסגניים או הנוק-אאוט) לפתח באופן ספונטני מחלת כבד. עם זאת, יש לציין כי מוטציות אלה הם נדירים מאוד בבני אדם, מחיקה או ביטוי מעל של גן אחד (g., ob/ob העכבר) לא יכול לחקות את האטיולוגיה של מחלת האדם multifactorial ברמה המולקולרית8,9. כמו כן, המחלה שנרכשה על ידי עכברים לאחר מניפולציה תזונתיים או תרופתי לא יכול לחקות את ההשפעות של דיאטות אדם הקשורים לפיתוח של NAFLD באדם8. עם זאת, מודלים בעלי חיים הקלו התפתחויות בהבנת NAFLD וגישה זו היא כיום האסטרטגיה הנפוצה ביותר במחקר במעבדה. עם זאת, השכפול בבני אדם של תוצאות שהתקבלו במודלים של בעלי חיים נכשל שוב ושוב, דבר שגרם לתרגום עני למרפאה10.
לכן, במודלים של חוץ גופית של NAFLD עשוי לשחק תפקיד בסיסי בהסבר מנגנונים מולקולריים של התקדמות NAFLD, והם מייצגים כלי רב ערך למסך מספר גדול של תרכובות. תרביות תאים ראשוניים, קווי תאים מונצח וביופסיות כבד שימשו בהרחבה למטרות מחקר11. הרופא הראשי האדם הראשוני דומה מאוד לתנאים קליניים אנושיים, אבל יש מספר מוגבל של תורמים, ותרבויות התא הראשי להראות מהווה המסכן העניים בשל השונות של התאים. תצפיות אלה, יחד עם סוגיות אתיות ולוגיסטיות, הביאו לשימוש בתאי ההיפטציטים הראשיים האנושייםבגיל 12. כך, קווי הכבד בתאי מייצגים חלופה נוחה, שיש יתרונות חיוניים מספר על התרבות העיקרית, כמו קווי הכבד בתאי לצמוח בהתמדה, יש תוחלת חיים כמעט בלתי מוגבל, יש פנוטיפים יציבה. יתר על כן, קווי התא נגישים בקלות, תנאי התרבות של קווי תא הכבד הם פשוטים יותר מאשר אלה של hepatocytes הראשי הם סטנדרטיים בין מעבדות שונות.
כאן, אנו מתארים בפירוט מודל מבוסס תא מבחנה של הכבד המבוסס על שלפוחית הצער, מיוצגת על ידי בתאי HepaRG כתית שטופלו עם חומצת שומן נתרן oleate. קו התאים HepaRG הוקם מחולה נקבה מושפע דלקת הפטיטיס C וכיתה אדמונדסון אני מבדיל היטב גידול בכבד14. קו הטלפון HepaRG הוא קו מחולל אנושי בעל עוצמה אנושית המסוגל להבדיל באמצעות חשיפה ל-2% diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כלפי שני פנוטיפים סלולריים שונים: כגון המרה ותאים המרופציט. הבדיל התאים HepaRG (dHepaRG) לשתף כמה תכונות ומאפיינים עם heparg מבוגרים ולהחזיק את היכולת לבטא גנים ספציפיים לכבד כגון אלבומין, Aldol, ציטוכרום P450 2E1 (CYP2E1), ו ציטוכרום P450 3A4 (CYP3A4)13 (שלב 3). הטיפול בתאים dHepaRG עם מלח חומצת שומן נתרן אולאט (250 μm) עבור 5 ימים להוביל לדור של טיפות השומנים cytoplasmic, מחקה את ההשפעות של כבד שומני14,15,17,18 ( שלב 4). הצטברות של טיפות שומנים בדם ניתן לזהות בקלות על ידי שמן אדום כתמי O (שלב 5), שומן lysochrome לצבוע מסיסים הכתמים טריגליצרידים נייטרלית ושומנים אדום כתום. כדי לכמת ביעילות שומנים ב dHepaRG שומן, כאן אנו ממחישים ניתוח ציטופלוורימטרית לאחר הצביעת עם 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-טטרמתיל-4-בורה-3a, 4a-di,-s-indacene (bodipy 505/515) (שלב 6), ליפול ב כדי תאיים גופי השומנים המשמש תווית טיפות השומנים19. יתר על כן, כאן אנו מראים כיצד להעריך הסטרומטוזיס על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותי (שלב 7) הביטוי הגנטי רגולציה של כמה גנים מטבוליים בתאי dHepaRG. כדי לאפיין עוד ולכמת את הצטברות של טיפות שומנים לאחר הטיפול נתרן אולאט, אנו ביצעו בעקביות אנטי סטוקס מיקרוסקופית פיזור (מכוניות) מיקרוסקופ (שלב 8), טכניקה חדשנית המאפשרת הדמיה וכימות של טיפות השומנים ללא תיוג20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד להבדיל בין תאי heparg וכיצד לגרום למצב של שלפוחית השתיקה על ידי נתרן אולאט הטיפול (איור 1א). ואכן, לעומת התאים האחרים קרצינומה של hepatocellular (HCC) קווי תא, קו התאים heparg מציג תכונות של האדם בוגרים hepatציטים, המייצג חלופה בעלת ערך ל ex vivo טיפח האדם הראשי hepatצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפרופ ‘ כריסטיאן טרפו (INSERM U871, ליון, צרפת), שסיפק באדיבות תאי HepaRG. אנחנו אסירי תודה לריטה אפודיה. לעזרה ניהולית עבודה זו נתמכת על ידי MIUR-Ministero dell, האוניברסיטה הרומית (FIRB 2011 – 2016 RBAP10XKNC) ו Sapienza אוניברסיטת רומא (פרוט. C26A13T8PS; פרוט. C26A142MCH; פרוט. C26A15LSXL).
Materials
| Hyclone HyClone Fetal Clone II | GE Healthcare | SH30066 | |
| William’s E medium with GlutaMAX | Thermofisher | 32551087 | |
| Penicillin/streptomycin | SIGMA | P4333 | |
| Insulin | SIGMA | I9278 | |
| hydrocortisone hemisuccinate | SIGMA | H2270 | |
| DMSO, dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2438 | |
| Sodium Oleate | SIGMA | O7501 | |
| Methanol | SIGMA | 179337 | |
| Isopropanol | SIGMA | 278475 | |
| BODIPY 505/515 | Thermofisher | D3921 | |
| PBS | Thermofisher | 14190-250 | |
| Formaldehyde solution | SIGMA | 252549 | |
| RNAse free DNAseI | Promega | M198A | |
| Glass-bottomed dishes | Willco Wells | GWST-5040 | |
| Oil Red solution | SIGMA | O625 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution | Promega | G3582 | |
| q-PCR oligo name | Sequence | ||
| ACACB FOR | CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA | ||
| ACACB REV | CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG | ||
| b-actin FOR | GCACTCTTCCAGCCTTCCT | ||
| b-actin REV | AGGTCTTTGCGGATGTCCAC | ||
| ALBUMIN FOR | TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG | ||
| ALBUMIN REV | AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC | ||
| ALDOB FOR | GCATCTGTCAGCAGAATGGA | ||
| ALDOB REV | TAGACAGCAGCCAGGACCTT | ||
| APOB FOR | CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG | ||
| APOB REV | CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA | ||
| APOC3 FOR | CTCAGCTTCATGCAGGGTTA | ||
| APOC3 REV | GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG | ||
| CPT1A FOR | TCATCAAGAAATGTCGCACG | ||
| CPT1A REV | GCCTCGTATGTGAGGCAAAA | ||
| CYP2E1 FOR | TTGAAGCCTCTCGTTGACCC | ||
| CYP2E1 REV | CGTGGTGGGATACAGCCAA | ||
| CYP3A4 FOR | CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT | ||
| CYP3A4 REV | TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA | ||
| GAPDH FOR | TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | ||
| GAPDH REV | AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC | ||
| GPAM FOR | TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT | ||
| GPAM REV | ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA | ||
| IL6 FOR | CCTGAACCTTCCAAAGATGGC | ||
| IL6 REV | ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG | ||
| PDK4 FOR | ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC | ||
| PDK4 REV | TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG | ||
| PLIN2 FOR | TTGCAGTTGCCAATACCTATGC | ||
| PLIN2 REV | CCAGTCACAGTAGTCGTCACA | ||
| PLIN4 FOR | AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC | ||
| PLIN4 REV | GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC | ||
| SCD FOR | TCTAGCTCCTATACCACCACCA | ||
| SCD REV | TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC | ||
| SLC2A1 FOR | TGCTCATCAACCGCAACGAG | ||
| SLC2A1 REV | CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG | ||
| 18S FOR | CGCCGCTAGAGGTGAAATTC | ||
| 18S REV | TTGGCAAATGCTTTCGCTC |
References
- Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
- Byrne, C. D., Targher, G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology. 62 (1), 47-64 (2015).
- Marra, F., Gastaldelli, A., Svegliati Baroni, G., Tell, G., Tiribelli, C. Molecular basis and mechanisms of progression of non- alcoholic steatohepatitis. Trends in Molecular Medicine. 14, 72-81 (2008).
- Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
- Banini, B. A., Sanyal, A. J. Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (3), 134-141 (2017).
- Takahashi, Y., Sugimoto, K., Inui, H., Fukusato, T. Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 21 (13), 3777-3785 (2015).
- Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
- Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (2), 230-237 (2018).
- Nagarajan, P., Mahesh Kumar, M. J., Venkatesan, R., Majundar, S. S., Juyal, R. C. Genetically modified mouse models for the study of nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of. Gastroenterology. 18 (11), 1141-1153 (2012).
- Oseini, A. M., Cole, B. K., Issa, D., Feaver, R. E., Sanyal, A. J. Translating scientific discovery: the need for preclinical models of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology International. 12 (1), 6-16 (2018).
- Ramboer, E., Vanhaecke, T., Rogiers, V., Vinken, M. Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes. Methods in Molecular Biology. 1250, 53-76 (2015).
- Gómez-Lechón, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).
- Marion, M. J., Hantz, O., Durantel, D. The HepaRG cell line: biological properties and relevance as a tool for cell biology, drug metabolism, and virology studies. Methods in Molecular Biology. 640, 261-272 (2010).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Anthérieu, S., Rogue, A., Fromenty, B., Guillouzo, A., Robin, M. A. Induction of vesicular steatosis by amiodarone and tetracycline is associated with up-regulation of lipogenic genes in HepaRG cells. Hepatology. 53 (6), 1895-1905 (2011).
- Rouge, A., et al. PPAR agonists reduce steatosis in oleic acid-overloaded HepaRG cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 276 (1), 73-81 (2014).
- Belloni, L., et al. Targeting a phospho-STAT3-miRNAs pathway improves vesicular hepatic steatosis in an in vitro and in vivo model. Scientific Reports. 8, 13638 (2018).
- Nunn, A. D. G., et al. The histone deacetylase inhibiting drug Entinostat induces lipid accumulation in differentiated HepaRG cells. Scientific Reports. 6, 28025 (2016).
- Donato, M. T., et al. Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells. Chemico-Biological Interactions. 181 (3), 417-423 (2009).
- Hellerer, T., Axäng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (37), 14658-14663 (2007).
- Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), 51092 (2012).
- Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F., Guguen-Guillouzo, C. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
- Nelson, L. J., et al. Human hepatic HepaRG cells maintain an organotypic phenotype with high intrinsic CYP450 Activity/metabolism and significantly outperform standard HepG2/C3A cells for pharmaceutical and therapeutic applications. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 120 (1), 30-37 (2017).
- Gerets, H. H. J., Tilmant, K., Gerin, B., Chanteux, H., Depelchin, B. O., Dhalluin, S., Atienzar, F. A. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
- Pusl, T., et al. Free fatty acids sensitize hepatocytes to bile acid-induced apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (3), 441-445 (2008).
- Gentile, C. L., Pagliassotti, M. J. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Nutritional Biochemistry. 19 (9), 567-576 (2008).
- Mei, S., et al. Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes. Journal of Pharmacological Experimental Therapy. 339, 487-498 (2011).
- Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. Journal of Biological Chemistry. 281, 12093-12101 (2006).
- Moravcová, A., Červinková, Z., Kučera, O., Mezera, V., Rychtrmoc, D., Lotková, H. The effect of oleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity on rat hepatocytes in primary culture. Physiological Research. 64, 627-636 (2015).
- Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 133 (4), 477-480 (2010).
- Rinia, H. A., Burger, K. N., Bonn, M., Müller, M. Quantitative label-free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy. Biophysical Journal. 95 (10), 4908-4914 (2008).
- Waschatko, G., Billecke, N., Schwendy, S., Jaurich, H., Bonn, M., Vilgis, T. A., Parekh, S. H. Label-free in situ imaging of oil body dynamics and chemistry in germination. Journal of The Royal Society Interface. 13 (123), (2016).
- Jüngst, C., Winterhalder, M. J., Zumbusch, A. Fast and long term lipid droplet tracking with CARS microscopy. Journal of Biophotonics. 4 (6), 435-441 (2011).
- Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
- Cohen, S. Lipid droplets as organelles. International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
