Inducir y caracterizar la esteatosis vesicular en células hepa-repartidas diferenciadas
Summary
En este estudio, describimos un protocolo detallado para inducir esteatosis vesicular hepática en células HepaRG diferenciadas con el oleato de sodio de sal de ácido graso y empleamos métodos para la detección y cuantificación de la acumulación de lípidos, incluyendo anti-Stokes coherentes Microscopía de dispersión Raman (CARS), análisis citofluorimétrico, tinción O de color rojo aceite y qPCR.
Abstract
La esteatosis hepática representa una disfunción metabólica que resulta de una acumulación de gotas lipídicas que contienen triglicéridos en hepatocitos. La acumulación excesiva de grasa conduce a una enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), que es potencialmente reversible y puede evolucionar a esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y, finalmente, a cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC). Los mecanismos moleculares que vinculan la acumulación de lípidos en hepatocitos con la progresión a NASH, daño hepático irreversible, fibrosis, cirrosis, e incluso HCC todavía no está claro. Para ello, se han desarrollado varios modelos in vitro e in vivo para dilucidar los procesos patológicos que causan la NAFLD. En el presente estudio, describimos un modelo celular para la inducción de esteatosis vesicular hepática que consiste en células HepaRG hepáticas humanas diferenciadas por DMSO tratadas con el oleato de sodio de sal de ácido graso. De hecho, las células HepaRG tratadas con oleato sódico acumulan gotas lipídicas en el citoplasma y muestran características típicas de la esteatosis. Este modelo humano in vitro representa una alternativa valiosa a los modelos de ratones in vivo, así como a los principales hepatocitos humanos. También presentamos una comparación de varios métodos para la cuantificación y evaluación de la acumulación de grasa en células HepaRG, incluyendo la tinción de aceite rojo O, la medición de Bodipy citofluorimétrica, el análisis de la expresión génica metabólica por qPCR y los anti-Stokes coherentes Microscopía de dispersión Raman (CARS). La imagen CARS combina la especificidad química de la espectroscopia Raman, una técnica de análisis químico bien conocida en aplicaciones de ciencia de materiales, con los beneficios de las microscopías ópticas no lineales de alta velocidad y alta resolución para permitir una precisión precisa cuantificación de la acumulación de lípidos y la dinámica de gotas de lípidos. El establecimiento de un modelo in vitro eficiente para la inducción de esteatosis vesicular, junto con un método preciso para la cuantificación y caracterización de la acumulación de lípidos, podría conducir al desarrollo de un diagnóstico en etapa temprana de NAFLD a través de la identificación de marcadores moleculares, y a la generación de nuevas estrategias de tratamiento.
Introduction
La esteatosis hepática se define como acumulación de grasa intrahepática, dentro de las gotas lipídicas que contienen triglicéridos, de al menos el 5% del peso hepático. El almacenamiento prolongado de lípidos hepáticos es un proceso potencialmente reversible, sin embargo, puede conducir a disfunción metabólica hepática, inflamación y formas avanzadas de enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), la causa predominante de la enfermedad hepática crónica en muchas partes de el mundo1,2. La NAFLD es una enfermedad multifactorial que puede evolucionar a la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) más agresiva, que a su vez puede progresar a cirrosis y, en un pequeño porcentaje de pacientes, al carcinoma hepatocelular (HCC)1,3. Actualmente no se dispone de terapia aprobada como tratamiento específico para el NAFLD y la combinación de modificaciones de dieta y estilo de vida sigue siendo el pilar de la gestión de NAFLD y NASH4,5,6.
Los mecanismos moleculares que conducen al desarrollo de esteatosis hepática en la patogénesis de la NAFLD todavía están por esclarecer 7 . En este contexto, se han desarrollado modelos de ratón para estudiar la progresión de la enfermedad de la esteatosis humana. Existe una gran variedad de modelos diferentes, y cada uno tiene sus ventajas y desventajas, incluyendo modelos genéticos, nutricionales y químicamente inducidos que combinan diferentes enfoques. Los ratones genéticamente modificados (transgénicos o noqueadores) desarrollan espontáneamente enfermedad hepática. Sin embargo, cabe señalar que estas mutaciones son muy raras en los seres humanos y la deleción o la sobreexpresión de un solo gen (por ejemplo, ratón ob/ob) pueden no imitar la etiología de la enfermedad humana multifactorial a nivel molecular8,9. Del mismo modo, la enfermedad adquirida por los ratones después de la manipulación dietética o farmacológica puede no imitar los efectos de las dietas humanas asociadas con el desarrollo de NAFLD en el hombre8. Sin embargo, los modelos animales han facilitado la evolución de la NAFLD y este enfoque es actualmente la estrategia más utilizada en la investigación de laboratorio. Sin embargo, la replicación en humanos de los resultados obtenidos en modelos animales ha fracasado repetidamente, causando una mala traducción a la clínica10.
Por lo tanto, los modelos in vitro de NAFLD pueden desempeñar un papel fundamental en la esclarecimiento de los mecanismos moleculares de la progresión de la NAFLD, y representan una herramienta valiosa para examinar un gran número de compuestos. Cultivos celulares primarios, líneas celulares inmortalizadas y biopsias hepáticas se han utilizado ampliamente con fines de investigación11. Los hepatocitos humanos primarios se asemejan mucho a las condiciones clínicas humanas, pero hay un número limitado de donantes, y los cultivos celulares primarios muestran una reproducción deficiente debido a la variabilidad de las células. Estas observaciones, junto con cuestiones éticas y logísticas, han dado lugar a que el uso de hepatocitos primarios humanos sea limitado12. Por lo tanto, las líneas de células hepáticas representan una alternativa conveniente, teniendo varias ventajas esenciales sobre el cultivo primario, ya que las líneas celulares hepáticas crecen constantemente, tienen una vida útil casi ilimitada, y tienen un fenotipo estable. Además, las líneas celulares son fácilmente accesibles y las condiciones de cultivo de las líneas celulares hepáticas son más simples que las de los hepatocitos primarios y están estandarizadas entre diferentes laboratorios.
Aquí, describimos en detalle un modelo in vitro basado en células de esteatosis vesicular hepática, representado por células HepaRG diferenciadas hepáticas tratadas con el oleato de sodio de ácido graso. La línea celular hepargal se estableció a partir de una paciente afectada por la infección por hepatitis C y un tumor hepático bien diferenciado de grado I de Edmondson14. La línea celular HepaRG es una línea celular progenitora bipotente humana capaz de diferenciarse al exponerse al 2% de sulfóxido de dimetil (DMSO) hacia dos fenotipos celulares diferentes: células biliares y células similares a hepatocitos. Las células HepaRG diferenciadas (dHepaRG) comparten algunas características y propiedades con hepatocitos adultos y poseen la capacidad de expresar de forma estable genes específicos del hígado como la albúmina, AldolaseB, el citocromo P450 2E1 (CYP2E1) y el citocromo P450 3A4 (CYP3A4)13 (paso 3). El tratamiento de las células dHepaRG con el oleato sódico de sal de ácido graso (250 m) durante 5 días conduce a la generación de gotas lipídicas citoplásmáticas, imitando los efectos del hígado graso14,15,17,18 ( paso 4). La acumulación de gotas lipídicas puede ser fácilmente detectada por la tinción de aceite rojo O (paso 5), un tinte soluble en grasa lisocromo que mancha triglicéridos neutros y lípidos rojo-naranja. Para cuantificar eficientemente los lípidos en dHepaRG graso, aquí ilustramos el análisis citofluorimétrico después de la tinción con 4,4-difluoro-1,3,5,7-tetrametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (paso 6), una sonda fluorescente lipofílica que localiza a cuerpos de lípidos intracelulares y se ha utilizado para etiquetar las gotas de lípidos19. Además, aquí mostramos cómo evaluar la esteatosis mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) (paso 7) desregulación de la expresión génica de varios genes metabólicos en células dHepaRG. Para caracterizar y cuantificar aún más la acumulación de gotas de lípidos después del tratamiento con oleato sódico, realizamos una microscopía coherente de dispersión anti-Stokes Raman (CARS) (paso 8), una técnica innovadora que permite la visualización y cuantificación de gotas de lípidos sin etiquetar20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe cómo diferenciar las células HepaRG y cómo inducir esteatosis vesicular mediante el tratamiento con oleato sódico (Figura1A). De hecho, en comparación con otras líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano (HCC), la línea celular HepaRG presenta características de hepatocitos humanos adultos, lo que representa una valiosa alternativa a los hepatocitos humanos primarios cultivados ex vivo13,<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al profesor Christian Trepo (INSERM U871, Lyon, Francia), quien amablemente proporcionó células HepaRG. Estamos agradecidos a Rita Appodia por su ayuda administrativa. Este trabajo fue apoyado por MIUR- Ministero dell’istruzione, dell’universitá e della ricerca (FIRB 2011-2016 RBAP10XKNC) y la Universidad Sapienza de Roma (prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).
Materials
| Hyclone HyClone Fetal Clone II | GE Healthcare | SH30066 | |
| William’s E medium with GlutaMAX | Thermofisher | 32551087 | |
| Penicillin/streptomycin | SIGMA | P4333 | |
| Insulin | SIGMA | I9278 | |
| hydrocortisone hemisuccinate | SIGMA | H2270 | |
| DMSO, dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2438 | |
| Sodium Oleate | SIGMA | O7501 | |
| Methanol | SIGMA | 179337 | |
| Isopropanol | SIGMA | 278475 | |
| BODIPY 505/515 | Thermofisher | D3921 | |
| PBS | Thermofisher | 14190-250 | |
| Formaldehyde solution | SIGMA | 252549 | |
| RNAse free DNAseI | Promega | M198A | |
| Glass-bottomed dishes | Willco Wells | GWST-5040 | |
| Oil Red solution | SIGMA | O625 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution | Promega | G3582 | |
| q-PCR oligo name | Sequence | ||
| ACACB FOR | CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA | ||
| ACACB REV | CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG | ||
| b-actin FOR | GCACTCTTCCAGCCTTCCT | ||
| b-actin REV | AGGTCTTTGCGGATGTCCAC | ||
| ALBUMIN FOR | TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG | ||
| ALBUMIN REV | AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC | ||
| ALDOB FOR | GCATCTGTCAGCAGAATGGA | ||
| ALDOB REV | TAGACAGCAGCCAGGACCTT | ||
| APOB FOR | CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG | ||
| APOB REV | CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA | ||
| APOC3 FOR | CTCAGCTTCATGCAGGGTTA | ||
| APOC3 REV | GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG | ||
| CPT1A FOR | TCATCAAGAAATGTCGCACG | ||
| CPT1A REV | GCCTCGTATGTGAGGCAAAA | ||
| CYP2E1 FOR | TTGAAGCCTCTCGTTGACCC | ||
| CYP2E1 REV | CGTGGTGGGATACAGCCAA | ||
| CYP3A4 FOR | CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT | ||
| CYP3A4 REV | TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA | ||
| GAPDH FOR | TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | ||
| GAPDH REV | AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC | ||
| GPAM FOR | TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT | ||
| GPAM REV | ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA | ||
| IL6 FOR | CCTGAACCTTCCAAAGATGGC | ||
| IL6 REV | ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG | ||
| PDK4 FOR | ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC | ||
| PDK4 REV | TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG | ||
| PLIN2 FOR | TTGCAGTTGCCAATACCTATGC | ||
| PLIN2 REV | CCAGTCACAGTAGTCGTCACA | ||
| PLIN4 FOR | AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC | ||
| PLIN4 REV | GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC | ||
| SCD FOR | TCTAGCTCCTATACCACCACCA | ||
| SCD REV | TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC | ||
| SLC2A1 FOR | TGCTCATCAACCGCAACGAG | ||
| SLC2A1 REV | CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG | ||
| 18S FOR | CGCCGCTAGAGGTGAAATTC | ||
| 18S REV | TTGGCAAATGCTTTCGCTC |
References
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