Индуцирование и характеристика везикулярного стеатоза в дифференцированных клетках гепаррг

Summary

В этом исследовании мы описываем подробный протокол для индуцирования печени везикулярный стеатоз в дифференцированных клетках HepaRG с жирным кислотным олеатом соли натрия и используем методы обнаружения и количественной оценки накопления липидов, включая когерентный анти-Стокс Рамана рассеяния (CARS) микроскопии, цитофторетриметрический анализ, Масло красный O окрашивания, и qPCR.

Abstract

Печеночный стеатоз представляет собой метаболическую дисфункцию, которая является результатом накопления триггеросодержащих липидных капель в гепатоцитах. Чрезмерное накопление жира приводит к безалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), которая потенциально обратима и может перерасти в безалкогольный стеатогепатит (NASH) и в конечном итоге цирроз и гепатоцеллюля). Молекулярные механизмы, связывающие накопление липидов в гепатоцитах с прогрессированием в NASH, необратимые повреждения печени, фиброз, цирроз печени и даже HCC до сих пор остается неясным. С этой целью, несколько in vitro и in vivo модели были разработаны, чтобы выяснить патологические процессы, которые вызывают NAFLD. В настоящем исследовании, мы описываем клеточной модели для индукции печени везикулярный стеатоз, который состоит из DMSO-дифференцированных человеческих печеночных клеток HepaRG, обработанных жирными кислотами соли олеата. Действительно, олейт натрия обработанных клеток HepaRG накапливают липидные капли в цитоплазме и показывают типичные особенности стеатоза. Эта человеческая модель in vitro представляет собой ценную альтернативу моделям in vivo мышей, а также первичным человеческим гепатоцитам. Мы также представляем сравнение нескольких методов количественной оценки и оценки накопления жира в клетках HepaRG, включая окодело oil Red O, цитофторметрическое измерение Бодипи, метаболический анализ экспрессии генов qPCR и когерентный анти-Стокс Рамана рассеяния (CARS) микроскопии. Изображение CARS сочетает в себе химическую специфичность Раманской спектроскопии, метода химического анализа, хорошо известного в материалах, с преимуществами высокоскоростных нелинейных оптических микроскопов с высоким разрешением количественное увеличение накопления липидов и динамики липидных капель. Создание эффективной модели in vitro для индукции везикулярного стеатоза, наряду с точным методом количественной оценки и характеристики накопления липидов, может привести к развитию ранней стадии диагностики НАФЛД с помощью идентификации молекулярных маркеров и создания новых стратегий лечения.

Introduction

Печеночный стеатоз определяется как внутрипеченое накопление жира, в триглицеридов, содержащих липидные капли, по крайней мере 5% от веса печени. Длительное хранение печеночных липидов является потенциально обратимым процессом, однако, это может привести к дисфункции обмена веществ печени, воспаление и передовые формы безалкогольных жировых заболеваний печени (NAFLD), преобладающей причиной хронических заболеваний печени во многих частях мир^1,2. НАФЛД является многофакторным заболеванием, которое может эволюционировать до более агрессивного безалкогольного стеатогепатита (NASH), который, в свою очередь, может прогрессировать до цирроза печени и, в небольшом проценте пациентов, гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)^1,3. Нет утвержденной терапии в настоящее время доступна в качестве конкретного лечения для NAFLD и сочетание диеты и изменения образа жизни остается столп НАФЛД и NASH управления^4,5,6.

Молекулярные механизмы, ведущие к развитию печеночного стеатоза в патогенезаНАФЛД, еще предстоит выяснить 7. В этом контексте были разработаны модели мышей для изучения прогрессирования болезни стеатоза человека. Существует множество различных моделей, и каждая из них имеет свои преимущества и недостатки, включая генетические, питательные и химически индуцированные модели, сочетающие различные подходы. Генетически модифицированные (трансгенные или нокаутирующие) мыши спонтанно развивают заболевания печени. Однако следует отметить, что эти мутации очень редки у людей и удаление или чрезмерное выражение одного гена (например, об/об мышь) не могут имитировать этиологию многофакторного заболевания человека на молекулярном уровне^8,9. Аналогичным образом, болезнь, приобретенная мышами после диетических или фармакологических манипуляций, не можетимитировать эффекты рациона человека, связанные с развитием НАФЛД у человека 8. Модели животных, однако, способствовали развитию понимания НАФЛД, и этот подход в настоящее время является наиболее часто используемой стратегией в лабораторных исследованиях. Тем не менее, репликация в организме человека результатов, полученных в животных моделях неоднократно не удалось, в результате чего плохой перевод в клинику¹⁰.

Таким образом, модели in vitro NAFLD могут играть основополагающую роль в выяснении молекулярных механизмов прогрессии NAFLD, и они представляют собой ценный инструмент для проверки большого количества соединений. Первичные клеточные культуры, увековеченные клеточные линии и биопсия печени широко используются в исследовательских целях^11. Первичные гепатоциты человека очень похожи на клинические условия человека, но существует ограниченное число доноров, а первичные клеточные культуры показывают плохую воспроизводимость из-за изменчивости клеток. Эти наблюдения, наряду с этическими и материально-техническими вопросами, привели к тому, что использование первичных гепатоцитов человека было ограничено^12. Таким образом, печеночные клеточные линии представляют собой удобную альтернативу, имеющая ряд существенных преимуществ перед первичной культурой, так как линии печеночных клеток постоянно растут, имеют почти неограниченный срок службы и имеют стабильный фенотип. Кроме того, клеточные линии легко доступны, а культурные условия линий печеночной клетки проще, чем у первичных гепатоцитов, и стандартизируются между различными лабораториями.

Здесь мы подробно описываем модель клеточного цитирования печени, представленную печеночными дифференцированными клетками HepaRG, обработанными олеатом натрия. Линия клеток HepaRG была создана из женщины,пациентки, пораженной инфекцией гепатита С, и Эдмондсона класса I хорошо дифференцированной опухоли печени¹⁴. Линия клеток HepaRG является человеческой бипотентной линии клеток-прародителей, способной дифференцироваться при воздействии 2% диметилсульфида (DMSO) на два различных клеточных фенотипа: желтоподобные и гепатоцитные клетки. Дифференцированные клетки HepaRG (dHepaRG) имеют некоторые особенности и свойства со взрослыми гепатоцитами и обладают способностью четко выражать гены, характерные для печени, такие как Альбумин, АлдолазеБ, Цитохром P450 2E1 (CYP2E1) и Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4)¹³ (шаг 3). Лечение клеток dHepaRG жирным кислотным олеатом натрия (250 мкм) в течение 5 дней приводит к выработке цитоплазмических липидных капель, имитирующих эффекты жировой печени^14,15,17,18 ( шаг 4). Накопление липидных капель может быть легко обнаружено маслом Red O окрашивания (шаг 5), лизохром жирорастворимый краситель, который окрашивает нейтральные триглицериды и липиды красно-оранжевый. Для эффективной количественной оценки липидов в жирной dHepaRG, здесь мы иллюстрируем цитофторетриметрический анализ после окрашивания с 4,4-дифторо-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3a,4a-диаза-с-индицен (Bodipy 505/515) (шаг 6), липофилии флоцентистые внутриклеточных липидных органов и был использован для обозначения липидных капель¹⁹. Кроме того, здесь мы показываем, как оценить стеатоз по количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) (шаг 7) генной экспрессии дерегуляции нескольких метаболических генов в клетках dHepaRG. Для дальнейшей характеристики и количественной оценки накопления липидных капель после лечения олеатом натрия, мы выполнили когерентную анти-Стокс Раман рассеяния (CARS) микроскопии (шаг 8), инновационный метод, который позволяет визуализации и количественной оценки липидные капли без маркировки^20,21.

Protocol

1. Подготовка культурных СМИ и реагентов Пролиферирующая среда: дополнить среду Уильяма E с GlutaMAX, 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 1% пенициллина / стрептомицина, 5 мкг/мл инсулина и 0,5 мкмизона здоров. Дифференциация среды: дополнить Уильяма E среды с GlutaMAX, 10% FBS, 1% пе?…

Representative Results

Этот протокол описывает эффективный метод, чтобы вызвать и охарактеризовать везикулярный стеатоз в DMSO дифференцированных клеток HepaRG натрия олеат лечения(рисунок 1A). Дифференциация клеток HepaRG.Чтобы эффективно вызвать дифференциацию…

Discussion

Этот протокол описывает, как дифференцировать клетки HepaRG и как вызвать везикулярный стеатоз лечения олеатом натрия(рисунок 1A). Действительно, по сравнению с другими человеческими линиями клеток гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), клеточная линия HepaRG демонстриру…

Materials

Hyclone HyClone Fetal Clone II	GE Healthcare	SH30066
William’s E medium with GlutaMAX	Thermofisher	32551087
Penicillin/streptomycin	SIGMA	P4333
Insulin	SIGMA	I9278
hydrocortisone hemisuccinate	SIGMA	H2270
DMSO, dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2438
Sodium Oleate	SIGMA	O7501
Methanol	SIGMA	179337
Isopropanol	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
Formaldehyde solution	SIGMA	252549
RNAse free DNAseI	Promega	M198A
Glass-bottomed dishes	Willco Wells	GWST-5040
Oil Red solution	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR oligo name	Sequence
ACACB FOR	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
b-actin FOR	GCACTCTTCCAGCCTTCCT
b-actin REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FOR	TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV	AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FOR	CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV	GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FOR	TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV	GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FOR	TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV	CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR	CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV	TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR	TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV	AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR	TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV	ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FOR	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV	ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FOR	ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV	TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FOR	TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV	CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FOR	AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REV	GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR	TCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REV	TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FOR	TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV	CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FOR	CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV	TTGGCAAATGCTTTCGCTC