विभेदित हेपाआरजी कोशिकाओं में वेसिकुलर स्टेटोसिस को प्रेरित और विशेषता
Summary
इस अध्ययन में, हम फैटी एसिड नमक सोडियम oleate के साथ विभेदित HepaRG कोशिकाओं में जिगर vesicular steatosis inducing के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन और लिपिड संचय का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए तरीकों को रोजगार, सुसंगत विरोधी स्टोक्स सहित रमन प्रकीर्णन (सीएआरएस) माइक्रोस्कोपी, साइटोफ्लोरीमीट्रिक विश्लेषण, तेल लाल हे धुंधला, और क्यूपीसीआर।
Abstract
हेपेटिक स्टेटासिस एक चयापचय रोग का प्रतिनिधित्व करता है जो ट्राइग्लिसराइड के संचय से परिणाम देता है जिसमें हेपेटोसाइट्स में लिपिड बूंदें होती हैं। अत्यधिक वसा संचय गैर शराबी फैटी लीवर रोग (NAFLD) की ओर जाता है, जो संभावित रूप से प्रतिवर्ती है और गैर शराबी steatohepatitis (NASH) और अंत में सिरोसिस और hepatotocellular कार्सिनोमा (एचसीसी) में विकसित हो सकता है। नैश, अपरिवर्तनीय जिगर की क्षति, फाइब्रोसिस, सिरोसिस, और यहां तक कि एचसीसी की प्रगति के साथ हेपाटोसाइट्स में लिपिड संचय को जोड़ने वाले आणविक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है। यह अंत करने के लिए, कई इन विट्रो और विवो मॉडल में NAFLD कारण रोग प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने के लिए विकसित किया गया है. वर्तमान अध्ययन में, हम जिगर vesicular steatosis है कि DMSO-अलग मानव यकृत HepaRG कोशिकाओं फैटी एसिड नमक सोडियम oleate के साथ इलाज के होते हैं के प्रेरण के लिए एक सेलुलर मॉडल का वर्णन. वास्तव में, सोडियम ओलेट-उपचारित हेपाआरजी कोशिकाओं कोशिकाद्रव्य में लिपिड बूंदों जमा और स्टेटोसिस की विशिष्ट विशेषताएं दिखा. यह इन विट्रो मानव मॉडल में विवो चूहों मॉडल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्राथमिक मानव hepatocytes के लिए एक मूल्यवान विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है. हम भी परिमाणीकरण और HepaRG कोशिकाओं में वसा संचय के मूल्यांकन के लिए कई तरीकों की तुलना प्रस्तुत, तेल लाल ओ धुंधला सहित, cytofluorimetric Bodipy माप, चयापचय जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण द्वारा QPCR, और सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन प्रकीर्णन (सीएआरएस) माइक्रोस्कोपी। CARS इमेजिंग रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी की रासायनिक विशिष्टता को जोड़ती है, एक रासायनिक विश्लेषण तकनीक सामग्री विज्ञान अनुप्रयोगों में अच्छी तरह से जाना जाता है, उच्च गति के लाभों के साथ, उच्च संकल्प गैर रेखीय ऑप्टिकल microscopies सटीक अनुमति देने के लिए लिपिड संचय और लिपिड छोटी बूंद गतिशीलता का परिमाणीकरण। vesicular steatosis के प्रेरण के लिए एक कुशल इन विट्रो मॉडल की स्थापना, परिमाणीकरण और लिपिड संचय की विशेषता के लिए एक सटीक विधि के साथ, के माध्यम से NAFLD के प्रारंभिक चरण निदान के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं आणविक मार्करों की पहचान, और नए उपचार रणनीतियों की पीढ़ी के लिए.
Introduction
हेपेटिक स्टेएटोसिस को इंट्राहेपेटिक वसा संचय के रूप में परिभाषित किया गया है, ट्राइग्लिसराइड युक्त लिपिड बूंदों के भीतर, जिगर के वजन का कम से कम 5%। लंबे समय तक यकृत लिपिड भंडारण एक संभावित प्रतिवर्ती प्रक्रिया है, हालांकि, यह जिगर चयापचय रोग, सूजन और nonalcoholic फैटी लीवर रोग के उन्नत रूपों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (NAFLD), के कई भागों में पुरानी जिगर की बीमारी का प्रमुख कारण दुनिया1,2. NAFLD एक बहुकारक रोग है कि अधिक आक्रामक गैर शराबी steatohepatitis (NASH) के लिए विकसित हो सकता है, जो बारी में सिरोसिस के लिए प्रगति कर सकते हैं और, रोगियों का एक छोटा सा प्रतिशत में, hepatotocellular कार्सिनोमा (एचसीसी)1,3. वर्तमान में एनएएफएलडी के लिए एक विशिष्ट उपचार के रूप में कोई अनुमोदित चिकित्सा उपलब्ध नहीं है और आहार और जीवन शैली में संशोधनों का संयोजन NAFLD और नैश प्रबंधन4,5,6 का स्तंभ बना हुआहै.
एनएएफएलडी के रोगजनन में यकृत स्तरावता के विकास के लिए अग्रणी आणविक तंत्र अभी भी स्पष्ट रूप से स्पष्ट हैं7. इस संदर्भ में, मानव स्थिति रोग प्रगति का अध्ययन करने के लिए माउस मॉडल विकसित किए गए हैं। विभिन्न मॉडलों के असंख्य मौजूद है, और हर एक अपने फायदे और नुकसान है, आनुवंशिक सहित, पोषण और रासायनिक प्रेरित मॉडल विभिन्न दृष्टिकोण के संयोजन. आनुवंशिक रूप से संशोधित (ट्रांसजेनिक या नॉकआउट) चूहों को सहज रूप से जिगर की बीमारी का विकास होता है। तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ये उत्परिवर्तन मनुष्यों में बहुत दुर्लभ हैं और किसी एकल जीन (उदा., ob/ob माउस) के अधिक-अभिव्यक्ति में आणविक स्तर8,9पर बहुकारक मानव रोग के ईटियोलॉजी की नकल नहीं कर सकता है। इसी तरह, आहार या औषधीय हेरफेर के बाद चूहों द्वारा प्राप्त रोग मानव 8 मेंNAFLD के विकास के साथ जुड़े आहार के प्रभाव की नकल नहीं कर सकते हैं. पशु मॉडल, तथापि, NAFLD की समझ में विकास की सुविधा है और इस दृष्टिकोण वर्तमान में प्रयोगशाला अनुसंधान में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया रणनीति है. फिर भी, पशु मॉडल में प्राप्त परिणामों के मनुष्यों में प्रतिकृति बार बार विफल रहा है, क्लिनिक में गरीब अनुवाद के कारण10.
इसलिए, NAFLD के इन विट्रो मॉडल NAFLD प्रगति के आणविक तंत्र स्पष्ट करने में एक मौलिक भूमिका निभा सकते हैं, और वे यौगिकों की एक बड़ी संख्या स्क्रीन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों, अमर कोशिका लाइनों और जिगर बायोप्सी बड़े पैमाने पर अनुसंधान प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया गया है11. प्राथमिक मानव hepatocytes बारीकी से मानव नैदानिक स्थितियों के समान है, लेकिन वहाँ दाताओं की एक सीमित संख्या है, और प्राथमिक सेल संस्कृतियों कोशिकाओं की परिवर्तनशीलता के कारण गरीब reproducibility दिखा. इन प्रेक्षणों के साथ-साथ नैतिक और संभारतंत्रीय मुद्दों के कारण मानव प्राथमिक हेपाटासाइट्स का उपयोग सीमित12हुआ है। इस प्रकार, यकृत सेल लाइनों एक सुविधाजनक विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं, प्राथमिक संस्कृति पर कई आवश्यक लाभ होने, के रूप में यकृत सेल लाइनों तेजी से बढ़ने, एक लगभग असीमित जीवन-विस्तार है, और एक स्थिर phenotype है. इसके अलावा, सेल लाइनों आसानी से सुलभ हैं और यकृत सेल लाइनों की संस्कृति की स्थिति प्राथमिक hepatocytes के उन लोगों की तुलना में सरल कर रहे हैं और विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच मानकीकृत कर रहे हैं.
यहाँ, हम विस्तार से जिगर vesicular steatosis के एक इन विट्रो सेल आधारित मॉडल का वर्णन, फैटी एसिड सोडियम oleate के साथ इलाज hepatic विभेदित HepaRG कोशिकाओं द्वारा प्रतिनिधित्व किया. HepaRG सेल लाइन हेपेटाइटिस सी संक्रमण से प्रभावित एक महिला रोगी और एक एडमंडसन ग्रेड मैं अच्छी तरह से अलग जिगर ट्यूमर14से स्थापित किया गया था. HepaRG सेल लाइन एक मानव द्विशक्तिजनक जनक कोशिका लाइन दो अलग सेल phenotypes की ओर 2% dimethyl sulfoxide (DMSO) के संपर्क में अंतर करने में सक्षम है: पित्त की तरह और hepatocyte की तरह कोशिकाओं. विभेदित हेपाआरजी कोशिकाओं (dHepaRG) वयस्क hepatocytes के साथ कुछ सुविधाओं और गुणों का हिस्सा है और इस तरह के Albumin, AldolaseB, Cytochrome P450 2E1 ( CYP2E1) के रूप में जिगर विशिष्ट जीन stably व्यक्त करने की क्षमता के अधिकारी13 (चरण 3).। 5 दिनों के लिए फैटी एसिड नमक सोडियम ओलेट (250 डिग्री सेल्सियस) के साथ dHepaRG कोशिकाओं का उपचार साइटोप्लाज्मिक लिपिड बूंदों की पीढ़ी के लिए नेतृत्व, फैटी लीवर के प्रभाव की नकल14,15,17,18 ( चरण 4). लिपिड बूंदों का संचय आसानी से तेल लाल ओ धुंधला द्वारा पता लगाया जा सकता है (कदम 5), एक lysochrome वसा में घुलनशील डाई कि तटस्थ ट्राइग्लिसराइड्स और लिपिड लाल नारंगी दाग. फैटी dHepaRG में लिपिड को कुशलता से परिमाणित करने के लिए, यहां हम 4,4-difluoro-1,3,5,7-tetraethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (py Bodi 505/515) (step Bodicent) (step 6) के साथ धुंधला करने के बाद साइटोफ्लोरीमीट्रिक विश्लेषण वर्णन करते हैं। इंट्रासेल्यूलर लिपिड निकायों के लिए और लिपिड बूंदों19लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, यहाँ हम बताते हैं कि कैसे मात्रात्मक polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा steatosis का मूल्यांकन करने के लिए (QPCR) (चरण 7) जीन अभिव्यक्ति dHepaRG कोशिकाओं में कई चयापचय जीन के विनियमन. सोडियम ओलेट उपचार के बाद लिपिड बूंदों के संचय की और विशेषता और मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमने सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन प्रकीर्णन (सीएआरएस) माइक्रोस्कोपी (चरण 8) का प्रदर्शन किया, एक अभिनव तकनीक जो दृश्य और परिमाणीकरण में सक्षम बनाती है 20,21लेबलिंग के बिना लिपिड बूंदें .
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में वर्णन किया गया है कि हेपाआरजी कोशिकाओं में अंतर कैसे करें और सोडियम ओलेट उपचार द्वारा वेसिकुलर स्टेटोसिस को कैसे प्रेरित करें (चित्र 1क)। वास्तव में, अन्य मानव hepatotocellular ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम prof. ईसाई Trepo (INSERM U871, Lyon, फ्रांस), जो कृपया HepaRG कोशिकाओं प्रदान धन्यवाद. हम प्रशासनिक मदद के लिए रीता Appodia के आभारी हैं. इस काम को MIUR- Ministero dell’istruzione, dell’universit] ई डेला ricerca (FIRB 2011-2016 RBAP10XKNC) और Sapienza रोम विश्वविद्यालय (प्रोट) द्वारा समर्थित किया गया था. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).
Materials
| Hyclone HyClone Fetal Clone II | GE Healthcare | SH30066 | |
| William’s E medium with GlutaMAX | Thermofisher | 32551087 | |
| Penicillin/streptomycin | SIGMA | P4333 | |
| Insulin | SIGMA | I9278 | |
| hydrocortisone hemisuccinate | SIGMA | H2270 | |
| DMSO, dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2438 | |
| Sodium Oleate | SIGMA | O7501 | |
| Methanol | SIGMA | 179337 | |
| Isopropanol | SIGMA | 278475 | |
| BODIPY 505/515 | Thermofisher | D3921 | |
| PBS | Thermofisher | 14190-250 | |
| Formaldehyde solution | SIGMA | 252549 | |
| RNAse free DNAseI | Promega | M198A | |
| Glass-bottomed dishes | Willco Wells | GWST-5040 | |
| Oil Red solution | SIGMA | O625 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution | Promega | G3582 | |
| q-PCR oligo name | Sequence | ||
| ACACB FOR | CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA | ||
| ACACB REV | CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG | ||
| b-actin FOR | GCACTCTTCCAGCCTTCCT | ||
| b-actin REV | AGGTCTTTGCGGATGTCCAC | ||
| ALBUMIN FOR | TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG | ||
| ALBUMIN REV | AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC | ||
| ALDOB FOR | GCATCTGTCAGCAGAATGGA | ||
| ALDOB REV | TAGACAGCAGCCAGGACCTT | ||
| APOB FOR | CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG | ||
| APOB REV | CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA | ||
| APOC3 FOR | CTCAGCTTCATGCAGGGTTA | ||
| APOC3 REV | GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG | ||
| CPT1A FOR | TCATCAAGAAATGTCGCACG | ||
| CPT1A REV | GCCTCGTATGTGAGGCAAAA | ||
| CYP2E1 FOR | TTGAAGCCTCTCGTTGACCC | ||
| CYP2E1 REV | CGTGGTGGGATACAGCCAA | ||
| CYP3A4 FOR | CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT | ||
| CYP3A4 REV | TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA | ||
| GAPDH FOR | TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | ||
| GAPDH REV | AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC | ||
| GPAM FOR | TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT | ||
| GPAM REV | ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA | ||
| IL6 FOR | CCTGAACCTTCCAAAGATGGC | ||
| IL6 REV | ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG | ||
| PDK4 FOR | ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC | ||
| PDK4 REV | TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG | ||
| PLIN2 FOR | TTGCAGTTGCCAATACCTATGC | ||
| PLIN2 REV | CCAGTCACAGTAGTCGTCACA | ||
| PLIN4 FOR | AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC | ||
| PLIN4 REV | GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC | ||
| SCD FOR | TCTAGCTCCTATACCACCACCA | ||
| SCD REV | TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC | ||
| SLC2A1 FOR | TGCTCATCAACCGCAACGAG | ||
| SLC2A1 REV | CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG | ||
| 18S FOR | CGCCGCTAGAGGTGAAATTC | ||
| 18S REV | TTGGCAAATGCTTTCGCTC |
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