Inducing og karakteriserer flytande steatosis i differensiert HepaRG celler

Summary

I denne studien, beskriver vi en detaljert protokoll for inducing leveren flytande steatosis i differensiert HepaRG celler med fettsyrer salt natrium oleat og ansette metoder for påvisning og kvantifisering av lipid akkumulering, inkludert sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) mikroskopi, cytofluorimetric analyse, olje rød O farging, og qPCR.

Abstract

Hepatic steatosis representerer en metabolsk dysfunksjon som resulterer fra en opphopning av triglyserider-inneholdende lipid dråper i hepatocytter. Overdreven fett opphopning fører til alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD), som er potensielt reversibel og kan utvikle seg til alkoholfrie steatohepatitis (NASH) og til slutt skrumplever og leverkreft (HCC). Den molekylære mekanismer knytte lipid akkumulering i hepatocytter med progresjon til NASH, irreversible leverskader, fibrose, skrumplever, og selv HCC fortsatt uklart. For dette formål har flere in vitro-og in vivo-modeller blitt utviklet for å belyse de patologiske prosessene som forårsaker NAFLD. I denne studien, beskriver vi en cellulær modell for induksjon av leveren flytande steatosis som består av DMSO-differensiert menneskelig hepatic HepaRG celler behandlet med fettsyrer salt natrium oleat. Faktisk, natrium oleat-behandlet HepaRG celler akkumuleres lipid dråper i cytoplasma og viser typiske trekk ved steatosis. Den menneskelige modellen in vitro representerer et verdifullt alternativ til in vivo mus modeller, så vel som til den primære menneskelige hepatocytter. Vi presenterer også en sammenligning av flere metoder for kvantifisering og evaluering av fett opphopning i HepaRG celler, inkludert olje rød O farging, cytofluorimetric Bodipy måling, metabolsk genuttrykk analyse av qPCR, og sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) mikroskopi. CARS Imaging kombinerer kjemiske spesifisitet av Raman spektroskopi, en kjemisk analyse teknikk velkjent i materialer vitenskap applikasjoner, med fordelene av høy hastighet, høy oppløsning ikke-lineære optiske microscopies å tillate presis kvantifisering av lipid akkumulering og lipid dråpe dynamikk. Etableringen av en effektiv in vitro modell for induksjon av flytande steatosis, sammen med en nøyaktig metode for kvantifisering og karakterisering av lipid akkumulering, kan føre til utvikling av tidlig fase diagnostisering av NAFLD via identifisering av molekylære markører, og til generering av nye behandlings strategier.

Introduction

Hepatic steatosis er definert som intrahepatic fett akkumulering, innen triglyserider inneholder lipid dråper, av minst 5% av leveren vekt. Langvarig hepatic lipid lagring er en potensielt reversibel prosess, men, det kan føre til leveren metabolske dysfunksjon, betennelser og avanserte former for alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD), den dominerende årsaken til kronisk leversykdom i mange deler av i verden^1,2. NAFLD er en multifaktoriell sykdom som kan utvikle seg til de mer aggressive alkoholfrie steatohepatitis (Nash), som igjen kan utvikle seg til skrumplever og, i en liten prosentandel av pasientene, til leverkreft (HCC)^1,3. Ingen godkjent terapi er for tiden tilgjengelig som en spesifikk behandling for NAFLD og kombinasjonen av kosthold og livsstil modifikasjoner forblir søyle av NAFLD og Nash Management^4,5,6.

De molekylære mekanismene som førte til utviklingen av hepatic steatosis i patogenesen av NAFLD fortsatt å være belyst⁷. I denne sammenhengen har musemodeller blitt utviklet for å studere menneskelig steatosis sykdomsprogresjon. En myriade av ulike modeller finnes, og hver og en har sine fordeler og ulemper, inkludert genetiske, ernæringsmessige og kjemisk indusert modeller kombinere ulike tilnærminger. Genmodifiserte (transgene eller knockout) mus spontant utvikle leversykdom. Imidlertid bør det bemerkes at disse mutasjoner er svært sjeldne hos mennesker og sletting eller over-uttrykk for et enkelt gen (f. eks OB/OB mus) kan ikke etterligne etiologi av multifaktoriell menneskelige sykdom på molekylær nivå^8,9. Likeledes kan sykdommen ervervet av mus etter kosttilskudd eller farmakologisk manipulasjon ikke etterligne virkningene av menneskelige dietter knyttet til utvikling av NAFLD i mann⁸. Animal modeller har imidlertid tilrettelagt utviklingen i forståelsen av NAFLD og denne tilnærmingen er i dag den mest brukte strategien i laboratoriet forskning. Likevel har replikering i mennesker av resultater som oppnås i dyremodeller gjentatte ganger mislyktes, forårsaker dårlig oversettelse til klinikken¹⁰.

Derfor, in vitro modeller av NAFLD kan spille en fundamental rolle i elucidating den molekylære mekanismer av NAFLD progresjon, og de representerer et verdifullt verktøy for å skjermen et stort antall forbindelser. Primær cellekulturer, udødeliggjort cellelinjer og lever biopsier har blitt mye brukt til forskningsformål¹¹. Primær menneskelig hepatocytter ligner nøye menneskelige kliniske forhold, men det er et begrenset antall givere, og primær cellekulturer viser dårlig reproduserbarhet på grunn av variasjon i cellene. Disse observasjonene, sammen med etiske og logistiske spørsmål, har resultert i bruk av menneskets primære hepatocytter er begrenset¹². Dermed representerer hepatic cellelinjer et praktisk alternativ, har flere viktige fordeler fremfor primær kultur, som hepatic cellelinjer vokse jevnt, har en nesten ubegrenset levetid, og har en stabil fenotype. Videre er cellelinjer lett tilgjengelige og kultur betingelsene for hepatic cellelinjer er enklere enn de primære hepatocytter og er standardisert blant ulike laboratorier.

Her beskriver vi i detalj en in vitro celle-basert modell av leveren flytande steatosis, representert ved hepatic differensiert HepaRG celler behandlet med fettsyrer natrium oleat. Den HepaRG cellelinjen ble etablert fra en kvinnelig pasient rammet av hepatitt C-smitte og en Edmondson karakter jeg godt differensiert leveren svulst¹⁴. Den HepaRG cellelinjen er en menneskelig bipotent Stamcelle linje i stand til å skille ved eksponering til 2% dimethyl sulfoxide (DMSO) mot to forskjellige celle fenotyper: galle-lignende og hepatocytter-lignende celler. Differensiert HepaRG celler (dHepaRG) dele noen funksjoner og egenskaper med voksen hepatocytter og har evnen til å stabilt uttrykke lever-spesifikke gener som albumin, AldolaseB, Cytokrom P450 2E1 (CYP2E1), og Cytokrom P450 3A4 (CYP3A4)¹³ (trinn 3). Behandling av dHepaRG celler med fettsyrer salt natrium oleat (250 μM) i 5 dager føre til generering av cytoplasmatiske lipid dråper, etterligne effekten av fettlever^14,15,17,18 ( Trinn 4). Opphopning av lipid dråper kan lett oppdages av Oil Red O farging (trinn 5), en lysochrome fettløselige fargestoff som flekker nøytrale triglyserider og lipider rød-oransje. For effektivt å kvantifisere lipider i fatty dHepaRG, her illustrerer vi cytofluorimetric analyse etter farging med 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-Bora-3a, 4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (trinn 6), en lipofile fluorescerende sonde som lokaliseres å intracellulære lipid kropper og har blitt brukt til å merke lipid dråper¹⁹. Videre viser vi hvordan man evaluerer steatosis ved kvantitativ polymerase kjedere reaksjon (qPCR) (trinn 7) genuttrykk dereguleringen av flere metabolske gener i dHepaRG celler. For ytterligere å karakterisere og kvantifisere akkumulering av lipid dråper etter natrium oleat behandling, utførte vi sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) mikroskopi (trinn 8), en innovativ teknikk som gjør det mulig visualisering og kvantifisering av lipid dråper uten merking^20,21.

Protocol

1. utarbeidelse av kultur Media og reagenser Voksende medium: supplement William ‘ s E medium med GlutaMAX, 10% fosterets storfe serum (FBS), 1% penicillin/Streptomycin, 5 μg/mL insulin og 0,5 μM Hydrocortisone hemisuccinate. Differensiering medium: supplement William ‘ s E medium med GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicillin/Streptomycin, 5 μg/mL insulin, 50 μM Hydrocortisone hemisuccinate og 2% DMSO. Frysing medium: supplement voksende medium med 10% DMSO. Natrium oleat: oppløses i 9…

Representative Results

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å indusere og karakterisere flytande steatosis i DMSO-differensiert HepaRG celler ved natrium oleat behandling (figur 1A). Differensiering av HepaRG celler.For å effektivt indusere differensiering, voksende celler må være sådd med lav tetthet (2,5 x 104 celler/cm2) i sprednings mediet. Når seeded ved lav tetthet, cellene aktivt dele og erverve en la…

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan å differensiere HepaRG celler og hvordan å indusere flytande steatosis ved natrium oleat behandling (figur 1A). Faktisk, sammenlignet med andre menneskelige leverkreft (HCC) cellelinjer, HepaRG cellelinjen utstillinger funksjoner av voksne menneskelige hepatocytter, som representerer et verdifullt alternativ til ex vivo dyrket primære menneskelige hepatocytter^{13,14 ,}…

Materials

Hyclone HyClone Fetal Clone II	GE Healthcare	SH30066
William’s E medium with GlutaMAX	Thermofisher	32551087
Penicillin/streptomycin	SIGMA	P4333
Insulin	SIGMA	I9278
hydrocortisone hemisuccinate	SIGMA	H2270
DMSO, dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2438
Sodium Oleate	SIGMA	O7501
Methanol	SIGMA	179337
Isopropanol	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
Formaldehyde solution	SIGMA	252549
RNAse free DNAseI	Promega	M198A
Glass-bottomed dishes	Willco Wells	GWST-5040
Oil Red solution	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR oligo name	Sequence
ACACB FOR	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
b-actin FOR	GCACTCTTCCAGCCTTCCT
b-actin REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FOR	TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV	AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FOR	CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV	GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FOR	TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV	GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FOR	TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV	CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR	CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV	TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR	TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV	AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR	TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV	ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FOR	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV	ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FOR	ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV	TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FOR	TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV	CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FOR	AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REV	GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR	TCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REV	TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FOR	TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV	CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FOR	CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV	TTGGCAAATGCTTTCGCTC