Method Article

在斑马鱼肿瘤异种移植物中宿主血管反应的Vivo成像和定量

DOI:

10.3791/59849

⸱

August 14th, 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这种方法的目的是通过异种移植哺乳动物肿瘤细胞进入带有荧光标记血管的斑马鱼胚胎,生成肿瘤血管生成体内模型。通过成像异种移植物和相关血管,可以得到血管原反应的定量测量。

Abstract

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肿瘤血管生成是抗癌治疗的主要目标,该方法的研制为研究体内肿瘤治疗过程提供了新的模型。斑马鱼异种移植是通过将哺乳动物肿瘤细胞植入受精后两天的斑马鱼胚胎的围观空间,然后测量在实验端点观察到的血管生成反应的程度,长达两天植入后。这种方法的主要优点是能够准确量化斑马鱼宿主血管生成反应的移植物。这使得详细的检查分子机制以及宿主与肿瘤对血管生成反应的贡献。异种移植的胚胎可以进行各种治疗,如用潜在的抗血管生成药物孵育,以研究抑制肿瘤血管生成的策略。血管生成反应也可以进行实时成像,以检查更动态的细胞过程。相对不高的实验技术、廉价的斑马鱼维护成本以及较短的实验时间,使得该模型对于开发控制肿瘤血管生成的策略特别有用。

Introduction

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血管生成是癌症的经典特征之一,是抗癌治疗的目标1,2。为了研究这一过程,通过将哺乳动物肿瘤细胞植入小鼠3等动物体内,建立了癌症异种移植模型。还开发了斑马鱼异种移植模型,包括将肿瘤细胞植入受精后2天(dpi)斑马鱼体内,导致斑马鱼血管快速生长到异种移植4中。

该协议描述了一个体内斑马鱼胚胎肿瘤异种移植模型,其中血管生成反应可以在整个异种移植中精确定量。这种方法允许研究者在体内检查支撑肿瘤血管生成反应的分子机制。斑马鱼的遗传可分性允许对宿主的贡献进行询问,而选择不同的肿瘤细胞系允许肿瘤对血管生成的贡献也检查5,6,7。此外,由于斑马鱼幼虫可渗透到小分子中,可以使用特定的通路抑制剂,也可以筛选药物库,以识别肿瘤血管生成8、9、10的新抑制剂。 1....

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Protocol

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1. 显微注射针的制备

  1. 打开微移液拉拔器并设置以下参数(为材料表中列出的微移液器拉拔器型号校准):热,680;拉, 75;速度, 40;时间, 55;压力: 530.
  2. 将硼硅酸盐玻璃毛细管固定到微移液器拉拔器中,然后拉毛细管,制成两根针。根据需要重复多针。

2. 用于植入的细胞培养

注:当使用该协议时,任何哺乳动物的癌细胞系都可用于将斑马鱼胚胎植入异种移植物。然而,不同细胞系5、11、12之间诱导的血管生成反应差异很大。B16-F1鼠黑色素瘤细胞已被证明在斑马鱼胚胎11中诱导强血管生成反应,因此适用于此协议。

  1. 在75cm2烧瓶中37°C下生长B16-F1细胞,使用MEM-α介质补充胎儿牛血清(FBS),最终浓度为10%(v/v)和青霉素/链霉素,最终浓度为100微克/mL。
  2. 从 95-100% 汇入 75 cm2 B16-F1 细胞瓶中取出介质,并在 5 mL 室温磷酸盐缓冲盐水 (PBS....

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Results

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通过在 6、24 和 48 hpi 处成像单个异种移植物,可以计算出不同时间点的血管生成反应,如图1A-C所示。最大的血管生成反应是在植入后24-48小时之间观察到的,移植血管的最大水平在2 dpi左右(图1A-C)。在补充电影1中可以看到一个典型的血管生成反应B16-F1异种移植从20.75 hpi到46 hpi的延时电影。这部电影是通过将按照此协议植入到2 dpf kdrl:EGFP胚胎中的异种移植物的成像技术而生成的。通过异种移植生长的血管形成一个曲折的网络,其血管大小和形态不规则,这是哺乳动物肿瘤20中异常血管网络的典型特征。我们模型中的血管生成反应是血管从普通主血管发芽到异种移植的结果,而不是以前的研究,后者报告亚肠道静脉是生长成异种移植4

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Discussion

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该协议的第一个关键步骤是肿瘤细胞的植入。至关重要的是,细胞被注射到一个位置,将允许异种移植成功植入胚胎,而不使胚胎水肿。过于前导的注射可以让细胞向心脏移动,阻塞血液并导致水肿,而太后注射将导致植入不良的异种移植。最好避免前注射,将针头插入蛋黄囊,使其在注射时指向远离心脏。最好通过在蛋黄囊圆部分的前半部分注射细胞来避免后注射。此外,细胞必须注射到蛋黄囊的腹腔,而不是横向到它,因为横向位置是更难查看和随后的图像。一旦研究人员相当擅长这一过程,每天可以植入大约200-300个胚胎异种移植物。血管生成反应的成像需要更长的时间,因为安装和成像异种移植需要很长时间;使用标准激光扫描共聚焦显微镜对15-20种异种移植物进行成像大约需要一个小时。

第二个关键步骤是使用三维图像分析软件测量移植血管化。需要按肿瘤体积定量,因为很难通过微注射获得一致大小的异种移植物。有必要仔细校准软件协议的设置,并一致地使用它们,以便获得所有实验的准确和公正的定量测量。设置强度的最小阈值(肿瘤体积和肿瘤血管体积)是此步骤的一个重要部分,因为它允许协议正确区分作为肿瘤/血管和背景荧光一部分的荧光。绘制围绕肿瘤异种移植的 .......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们感谢Alhad Mahagaonkar先生管理奥克兰大学斑马鱼设施和奥克兰大学医学院生物医学成像研究股,在延时共聚焦显微镜方面提供协助。这项工作得到了新西兰卫生研究理事会项目赠款(14/105)、新西兰皇家学会马斯登基金项目赠款(UOA1602)和奥克兰医学研究基金会项目赠款(1116012)给予J.W.A.的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
气瓶BOC011G异种移植
B16-F1 细胞ATCC细胞培养
BD 无基质胶 LDEV（细胞外基质混合物）康宁356235异种移植
硼硅酸盐玻璃毛细管Warner InstrumentsG100T-4外径 = 1.00 mm，内径 = 0.78 mm，长度 = 10 cm 细胞注射
细胞注射 细胞培养皿 直径 35 mmThermofisher NZNUN153066养鱼
细胞培养皿 直径 100 mmSigma-AldrichCLS430167-500EA养鱼
细胞培养瓶 75 cm2体外技术COR430641细胞培养
CellTracker GreenInvitrogenC2925细胞标记、储备液浓度（10 mM 的 DMSO 溶液）、工作浓度（0.2 μ无血清培养基中的 M）
二甲基亚砜Sigma-AldrichD8418药物处理，细胞标记
E3 培养基（在 2 L 水中 60x） 34.8 g NaCl

1.6 g KCl

5.8 g CaCl2·2H2O

9.78 g MgCl2·6H2O 用 NaOH 调节至 pH 7.2		内部 [1]养鱼
3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（三卡因）Sigma-AldrichE10521异种移植，成像
滤光片尖端 1,000 &μ;LVWR732-1491在多个步骤中使用
滤芯尖端 200 μLVWR732-1489在多步骤中使用
滤芯尖端 10 μLVWR732-1487在多个步骤中使用
荧光显微镜LeicaMZ16FA胚胎制备
FBS（新西兰来源）Thermofisher Scientific10091148细胞培养
手套任何商业品牌在多个步骤中使用
血细胞计数器细胞计数室 改良的 NeubauerHawksleyVetAC1000异种移植
Heraeus Multifuge X3R 离心机Thermofisher Scientific75004500细胞培养，细胞标记
Hoechst 33342Thermofisher Scientific62249细胞标记，原液浓度（DMSO 中 1 mg/ml），工作浓度（6 &μ;g/ml，在无血清培养基中）
低熔点，超纯琼脂糖Thermofisher 科学16520050成像
甲基纤维素Sigma-Aldrich9004 67 5异种移植
亚甲蓝sigma-AldrichM9140养鱼
微量加载器 0.5-20 μ用于加载微量毛细管的L型移液器吸头Eppendorf5242956003异种移植微量
移液器任何商业品牌在多个步骤中使用
微量移液器拉拔器 P 87Sutter Instruments异种移植
显微镜笼式培养箱Okolab延时成像
微波任何商业品牌成像
矿物油Sigma-AldrichM3516异种移植
最低必需培养基 （MEM） - alphaThermofisher Scientfic12561056细胞培养
MPPI-2 压力注射器应用科学仪器异种移植
Narishige 显微作器Narishige Group异种移植
尼康 D Eclipse C1 共聚焦显微镜尼康成像
N-苯硫脲 （PTU）Sigma-AldrichP7629养鱼业
PBSGibco10010023细胞培养
青霉素 链霉素Life Technologies15140122细胞培养
S1 移液器 Thermoscientific9501细胞培养
血清学条纹 10 mL康宁4488细胞培养
学条纹 25 mL康宁4489细胞培养
学条纹 5 mL康宁4485细胞培养
学条纹 2 mL康宁4486细胞培养
Terumo 针 22 GAmtechSH 182鱼类养殖
组织培养箱Thermofisher ScientficHeraCell 150i细胞培养
Tivozanib （AV951）AVEO Pharmaceuticals药物处理
转移移液管 3 mLMedirayRL200C养鱼业
胰蛋白酶/EDTA （0.25%）Life TechnologiesT4049细胞培养
镊子精细科学工具11295-10鱼类养殖
Volocity 软件 （v6.3）Improvision/Perkin Elmer图像分析
血清血清血清

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Rese....

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